硬件技术

从紫外、可见到近红外波长范围内的激光器都可以用作拉曼光谱分析的激发光源，典型的激光器有（不限于）：

• 紫外：244 nm, 266 nm, 320 nm, 355 nm, 405 nm
• 可见：458 nm, 473 nm, 515 nm, 532 nm, 594 nm, 633 nm, 660 nm
• 近红外：785 nm, 830 nm, 980 nm, 1064 nm

激光波长的选择对于实验的结果有着重要的影响：

灵敏度

拉曼散射强度与激光波长的四次方成反比，因此，蓝/绿可见激光的散射强度比近红外激光要强15 倍以上。

空间分辨率                      

在衍射极限条件下，激光光斑的直径可以根据公式D= 1.22 λ/NA 计算得出，其中λ 是激发激光的波长，NA 是所使用显微物镜的数值孔径。例如，采用数值孔径为0.9 的物镜，波长532 nm 激光的光斑直径理论上可以小到0.72 微米，在同样条件下使用785 nm 波长激光时，激光光斑直径理论上最小值为1.1 μm，因此，最终的空间分辨率在一定程度上取决于激发激光的选择。                        

可以基于样品特性对激发波长进行优化，例如：

• 蓝/ 绿色激光适合无机材料和共振拉曼实验( 如碳纳米管和其它碳材料) 以及表面增强拉曼实验(SERS) 红色和近红外激光(660 nm~830 nm) 适合于抑制样品荧光
• 紫外激光适合生物分子( 蛋白质、DNA、RNA 等) 的共振拉曼实验以及抑制样品荧光

拉曼光谱分析所使用的紫外激光器波长一般在244 nm~364 nm 范围内。

理论上，紫外拉曼光谱和可见拉曼光谱没有什么不同之处。但是实际上，紫外拉曼的实现有一些实际困难和不足之处必须予以考虑。

优势

• 对于某些特定样品来说，紫外激光与样品相互作用的方式与可见激光不同，例如：紫外光在半导体材料中的穿透深度一般在几个纳米的量级，因而紫外拉曼可以用来对样品表面的薄层( 常见于新型硅基材料SOI 材料) 进行选择性分析。再如紫外激发可以与蛋白质、DNA、RNA 等生物样品产生特定的共振增强进而对样品的结构进行特定的分析，而使用可见激发则无法实现。
• 通常使用紫外激发可以抑制荧光的影响，因为在紫外激发下拉曼信号和荧光信号在不同的光谱区域，不会受到干扰。而使用可见激光激发时，拉曼信号和荧光信号往往会重叠在一起，又由于荧光的信号强度是拉曼信号强度所无法比拟的，因此荧光信号会干扰甚至完全湮没拉曼信号。使用紫外激光激发时，拉曼信号仍位于靠近激光线附近的位置，而荧光则在较高波长的位置，由此拉曼和荧光信号不再重叠，荧光问题也不复存在。
• 紫外激发可以提高灵敏度，因为拉曼散射强度与激光波长的四次方成反比，所以波长325 nm 激发的拉曼强度是波长633 nm 激发的14 倍。

劣势

• 因为紫外光束看不见，并且紫外激光器相对更大型、更复杂，也更加昂贵，目前紫外拉曼实验依然属于高端技术，需要高水平专业技术人员操作。
• 由于紫外光子的能量更高，所以在紫外激光照射下样品更易于烧坏或者降解。尽管如此，像DuoScan 之类的新技术可以控制光束在样品上快速掠过，避免样品燃烧。例如，在325 nm 激光照射下，纤维素会在几个毫秒内被烧坏，而在DuoScan 模式下，可以超过5 分钟也不被烧坏。
• 很多为可见和红外拉曼分析而设计的拉曼系统不适合于进行紫外拉曼测量。紫外拉曼需要特殊镀膜的反射镜、显微物镜、衍射光栅和CCD 探测器以获得优化的实验结果。LabRAM HR Evolution 系列现代拉曼系统的配置可以在整个紫外到近红外波长范围内有效工作而无需在任何一方面进行折中。但不言而喻的是，额外的需求势必会提高制造成本。

拉曼光谱分析所使用的近红外激光波长一般在700 nm以上，例如785 nm、830 nm、980 nm 和1064 nm。使用近红外拉曼的一个关键原因是它能抑制荧光，但同样存在一些不利之处需予以考虑。尽管有时近红外拉曼非常有价值，但也不能作为所有样品的最佳解决方案。

优势

• 使用近红外激光常常可以抑制荧光干扰。荧光现象是一个双光子过程，首先需要吸收一个外来光子，然后再发射出一个荧光光子。与之不同的是，拉曼是一个单光子散射过程，无需吸收。很多种材料的吸收带位于可见区域，只有少数材料的吸收带位于近红外区域，因此在大多数情况下，近红外激光不会引起荧光( 因为吸收过程没有发生)。而拉曼却可以正常出现。当样品在可见激发下有很强的荧光干扰时，使用近红外拉曼是一个很好的解决方案，可以获得优质的拉曼光谱。

劣势

• 近红外激发会导致灵敏度降低，因为拉曼散射强度与激光波长的四次方成反比，因此，785 nm 激光激发的拉曼强度几乎只有532 nm 激光激发的拉曼强度的五分之一；与此同时，在近红外拉曼区域CCD 探测器的灵敏度也会降低，因此，与使用可见激光测量相比，要获得同样的光谱质量，近红外拉曼的测量时间相对长很多。
• 近红外激光的光束质量( 即光束宽度和发散度) 不是很适合做显微测量，使用近红外激光不得不在空间分辨率上做出一定的妥协，这使得最终结果不能与理论预测完全符合。

拉曼光谱仪中使用的激光滤光装置主要有两类：

光学滤光片

这些光学元件被安装在拉曼光束经过的光路之中，用来选择性地阻挡激光线( 瑞利散射)， 同时允许拉曼散射光通过到达光谱仪和探测器。每种激光波长需要配备配套的滤光片。目前投入使用的滤光片主要有两种类型，它们都无需用户干预或优化即可使用。

• Edge 滤光片

Edge 滤光片是一种长波通光学滤光片，它可以吸收波长低于某个数值的所有光而允许波长大于该数值的所有光高效率通过。例如，用于532 nm 激光器的Edge 滤光片可吸收波长在534 nm 以下( 即70 cm^-1 以下) 包括激光辐射在内的的所有光，波长大于534 nm 的光则可以通过，从而可以探测到从70 cm^-1 一直到4000 cm^-1 或者更高的拉曼光谱。Edge 滤光片在吸收和透过光谱区域之间的带边极为陡峭，对激光线提供了非常有效的阻挡。Edge 滤光片的优点是它在环境中非常稳定，其寿命可以说是无限的。

• 全息陷波滤光片

拉曼光谱仪使用的陷波滤光片也是与特定的激光波长相匹配的，它有很锐利的的吸收带，吸收带宽通常为几个纳米( 对应于几百个波数)。例如，用于532 nm 激光的陷波滤光片吸收中心就位于532 nm，激光线将被吸收，而此范围以外的拉曼光谱则可以透过。与Edge 滤光片不同的是，陷波滤光片的寿命有限，并且其性能会随时间推移而降低。陷波滤光片的优势是它可以同时测量斯托克斯
拉曼散射和反斯托克斯拉曼散射，这一点在某些特殊场合是非常有用的。

光谱仪滤光

配备三级单色仪的仪器还可以用“两级相减，单级光谱分光”的模式工作。其前两级单色仪作为一体，首先将瑞利散射光( 激光) 和拉曼散射光一起色散，并将瑞利散射光( 激光) 以及其它杂散光滤除，然后再重新组合在一起。第三级光谱仪以常规的方式将拉曼散射光色散分光后投射到探测器上。

这样使用三级单色仪的优势在于其激光过滤是无限可变的，可以使用任何一种激光光源工作。除此之外，它对激光的滤除效果非常完美，可以实现的频率下限最低达到4cm^-1~5cm^-1。然而，与更为常见的基于滤光片滤光的标准单级拉曼系统相比，这样一台仪器需要更多的专业技能才可以操作，因此，三级拉曼光谱仪很少用于常规的日常分析中。

CCD 探测器是一种硅基多通道阵列探测器，可以探测紫外、可见和近红外光。因为它是高感光度半导体器件，适合分析微弱的拉曼信号，再加之CCD 探测器允许进行多通道操作( 可以在一次采集中探测到整段光谱)，所以很适合用来检测拉曼信号。CCD 的应用很广泛，数码相机中CCD 可以用作传感器，而在科学光谱仪中使用更高级别的CCD 以获得更好的灵敏度、均一性和噪音特性。

CCD探测器一般是一维( 线状) 或二维( 面状) 的阵列，阵列由成千上万个独立的探测器元素组成( 也称为像元)。每个元素受到光的作用产生电荷――光越强，作用时间越长，产生的电荷越多。最终，读出电子元件把电荷从像元中引出，从而每个电荷都被读出测量。

在普通的拉曼光谱仪中，拉曼散射首先通过衍射光栅色散，然后投射到CCD 阵列的长轴上，第一个像元探测到光谱低波数起始信号，第二个像元探测到下一个光谱位置的信号，依此类推，最后一个像元将探测到光谱高波数终端信号( 如图所示)。

CCD 探测器需要冷却到较低温度以采集高质量光谱，冷却方式通常有两种：一种是半导体制冷，可达到的最低温度为-90℃；另一种是液氮低温制冷，最低温度达到-196℃。大多数拉曼光谱系统使用半导体制冷方式，但是对一些特殊应用，液氮冷却的探测器仍有其独特优势。

An Electron Multiplying CCD (EMCCD) is a special type of CCD detector, which uses the latest technology to enhance the spectrum quality when extremely low signal levels are present. This enhancement is particularly valuable when the Raman signal is very weak, since the electron multiplication process can result in good spectrum quality, unlike the conventional CCD where only a few of the stronger features can just be observed above the noise. The benefits of EM gain are clearly obvious in fast Raman spectral imaging,where the necessary short integration times can often result in signals which are barely visible above the noise when measured with a conventional CCD.

The EMCCD has two readout registers on the chip – a conventional register and an electron multiplying (EM) register. In the EM register, the clocking voltages used are higher than for conventional clocking, causing the electrons to acquire sufficient energy that impact ionization can occur. At this point, extra electrons are produced and stored in   the next pixel. There is only a small probability of electrons acquiring sufficient energy for impact ionization to occur (thus creating additional electrons), but since the readout register has many elements within it, significant gain factors are possible (up to ~1000x). The key benefit of an EMCCD is that the amplification occurs before readout of the signal, which means that the signal is not readout noise limited. In other words, through amplification, the signal is raised well above the noise floor which is largely determined by the noise of the readout electronics (pre-amplifier and A/D converter).

光谱分辨率是指把光谱特征、谱带分解成为分离的成分的能力。分析人员和研究者需要什么样的光谱分辨率是由他们面对的具体问题决定的。例如，用于基本的样品识别的常规分析只需要低/ 中光谱分辨率。相比之下，对于多晶型以及结晶性的表征常常需要高分辨率，因为这些现象在拉曼光谱上仅仅表现为非常细微的变化，在低分辨率实验中观察不到这些变化。

光谱分辨率是一个重要的实验参数。如果分辨率太低，就会丢失光谱信息，妨碍正确地识别和表征样品。如果分辨率太高，总的测量时间将会远远超过必要的时间。光谱分辨率“过低”或者“过高”取决于特定的应用以及期望从实验中得到什么样的信息。

一般来说，低/ 中分辨率适合进行简单的化学识别或者区分不同材料，而需要表征一些更加精细的光谱特征( 例如峰型或者峰位的微小变化) 时，高分辨率就变得必不可少了。有很多化学现象会导致这种细微的光谱变化：

结晶度

一般而言，当一种材料的结构从非晶态变化为结晶态时，拉曼峰将变得更强、更锐利。结晶度的微小变化都可以借助于高分辨率表征出来。

多晶型

多晶型是指材料有同样的化学式，但是其晶型却不相同。由于化学式相同，它们的拉曼光谱总体上是相似的，但是晶型对于单个化学键振动的影响会导致光谱的细微变化。因此，在整个光谱中观察到某些峰形峰位的微小变化也是意料之中的。

应力

某些材料( 大多是重要的半导体材料) 在承受拉力和压力时，它们的拉曼和发光光谱都会有所改变。对于半导体材料来说，在材料中特意引入应力能实现器件所需的半导体性或者发光属性，拉曼分析是表征这些拉力/ 压力的至关重要的工具。但是由于这种压力/ 拉力导致的效果是细微的，所以高分辨就是不可或缺的。

氢键

分子间或者分子内氢键所产生的弱相互作用能够引起拉曼光谱很小的变化，具有高分辨本领的光谱可以用来研究这样的相互作用。

蛋白质折叠

蛋白质的一级结构对于拉曼光谱当然有重要的决定作用，但是其二级、三级结构包括了局部或者更广泛的折叠，足以扰动其振动模式，进而影响到光谱。并且，其效果是细微的，只有高分辨分析才能对此进行表征。

色散型拉曼光谱仪的光谱分辨率主要由四个因素决定，在以下的讨论中，某一个因素对光谱分辨率的影响，是在假定其他所有因素保持不变的前提下考虑的。在实际问题中，所有这些因素都存在很多变化，这使得直接比较拉曼系统的性能变得非常困难。

光谱仪焦长

光谱仪光栅的焦长( 色散光栅到探测器的距离) 越长，相应的光谱分辨率也越高。一般情况下，拉曼光谱仪的焦长从200 mm ( 适用于低/ 中分辨率测量) 到800 mm ( 适用于高分辨率测量) 甚至更高。人们时常容易忽略的是，一款长焦长的光谱仪并不是只限于进行高分辨率的工作，通过选择合适的光栅( 下一节将要讨论)，高分辨率的光谱仪也可以工作在低分辨率模式下。这样，它不仅完美地适于低/ 中分辨率的常规分析，而且可以为更加特定的应用提供高分辨率分析。

衍射光栅

光栅刻线密度( 一般用每毫米刻线数目表示) 越高，相应的光谱分辨率也越高。一般情况下，拉曼光谱仪所使用的光栅刻线密度从300 gr/mm( 低分辨率) 到1800 gr/mm ( 高分辨率)，一些特殊用途的光栅可以高达2400 gr/mm 或者3600 gr/mm的，但是高密度光栅会存在一些局限性，不适合做常用的配置。利用高密度光栅提高光谱分辨率是有限度的，因为对于某一具体的光谱仪来说，无论从实用角度还是物理学角度，能够使用的最大的光栅密度都有一个上限。因此，光栅提供了一个提高光谱分辨率的初级方法，但是一旦达到了其极限，那就必须变换思路，考虑采用长焦长光谱仪。

激光波长

就某一波长而言，确定的光栅/ 光谱仪的色散能力通常被看作固定不变的。然而，由于拉曼光谱的单位是与相对于入射光子能量的( 拉曼位移，或者波数cm-1)，这意味着，当激发激光的波长由红外到可见直到紫外而变化时，光子能量逐渐变大，光谱分辨率将逐渐下降。要想在此范围内达到同样的光谱分辨率，拉曼光谱仪通常更高密度的光栅。比如：如果在近红外激发下使用的是600 gr/mm 的光栅，那么使用绿光时，就需要1200 gr/mm 或1800 gr/mm 的光栅以求达到相当的光谱分辨率。

探测器

大多数拉曼光谱系统只有一套探测器，所以实际上用户对此项因素无法控制或调整。尽管如此，需要注意的是不同的探测器的像元尺寸是不同的，像元尺寸越小，能够达到的光谱分辨率就越高。

显微拉曼光谱仪把拉曼光谱仪和标准的光学显微镜耦合在一起。激发激光束通过显微镜聚焦为一个直径在0.5 μm~1.0 μm 大小的微小光斑。这一光斑所在范围内的拉曼信号通过显微镜回到光谱仪，然后得到光谱信息。

显微拉曼光谱仪的空间分辨率在微米尺度，为化学分析开启了一个新维度：

• 分析和鉴别尺度小至0.5 μm 的单个粒子
• 表征尺度小至0.5 μm 的样品特征
• 微观污染物的定位和鉴别
• 低至0.5 μm 的空间分辨率下样品特征的拉曼成像分析，显示样品成分分布

仅仅添加显微镜只能提高横向(XY) 空间分辨率，并不能提供纵轴方向(Z) 的空间分辨能力。只有共焦光路才能提供纵深方向(Z) 的空间分辨能力。目前使用的共焦设计有几种，其中一些是真共焦的，而另一些是赝共焦的，其实际效果也不尽相同。真共焦设计在光路上安装完全可以调节的共焦针孔光阑，可以达到微米量级的纵向分辨率，可以逐层分析多层薄层样品，即可以在纵向进行拉曼切片。

单纯添加显微镜只能提高横向(XY) 空间分辨率，并不能提高纵深方向(Z) 的空间分辨能力。只有共焦光路才能提高纵深方向(Z) 的空间分辨能力。目前使用的共焦设计有几种，其中一些是真共焦的，而另一些是赝共焦的，其实际效果也不尽相同。真共焦设计在光路上安装完全可以调节的共焦针孔光阑，可以达到微米量级的纵向分辨率，可以逐层分析多层薄层样品，即可以在纵向进行拉曼切片。