Anisotropy equation
吸收和发射分别对应于荧光分子的偶极矩与激发光或 发射光(电磁波)的电矢量之间的空间位置的关系。 换言之,如果用垂直偏振光激发荧光基团,那么发射 光所保留的垂直偏振的程度将取决于这些荧光基团在溶液 中自转的快慢程度。荧光基团在溶液中这种重新定向的运 动越快,发射光的退偏振度就越高;反之,荧光基团在溶 液中重新定向的运动越慢,发射光所保留的偏振度就越高。
要测量荧光的各向异性信息,必须在荧光光谱仪的激 发光光路和辐射光光路都放置偏振片,来对所使用或探测 的光进行选择。各向异性度是利用偏振光强度比值计算出 来的,如上面公式所示。公式中,IVV 代表在垂直偏振光 激发下,探测到的垂直偏振的发射光的强度。IVH 代表在 垂直偏振光激发下,探测到的水平偏振的发射光的强度。 G 是光栅校正因子,用于校正仪器系统对不同偏振方向的 光的响应差异。
Some useful equations for applying anisotropy, r and time-resolved anisotropy, r(t).
实验的基本原理是这样的:首先,激发光路和发射光 路中的偏振片都转动到垂直位置进行测量,测到的荧光强 度即 IVV;然后将发射光路中的偏振片都转动到水平位置 测量荧光强度 IVH。
各向异性公式中的因子“2”的出现是因为有两种正 交取向配置,VVz 的配置可以投影为 Hx 和 Hy 两种,因 而有两个 IVH 成分。与之有关的是,偏振度 p 常用来描述 只有一个水平分量的二维偏振参数,在此情况下,公式中 就没有因子“2”,而偏振度 p 则代替了各向异性度 r。
Time-resolved anisotropy measurement
再者,因子 G 是通过分别测量 HH 和 HV 偏振配置下 的荧光强度计算出来的。由脚标 r 代表的各向异性,常用 来作为分子尺寸、分子扩散和分子黏度的标识。
Temperature induced unfolding of BSA protein monitored by fluorescence anisotropy of intrinsic tryptophan residues
上页右下图中给出了用于分析荧光各向异性结果的几 个公式。前面已经讨论了荧光各向异性的基本公式,它们 也可以用来计算荧光衰减整体过程,给出时间分辨的荧光 各向异性结果(上图)。从时间分辨的荧光各向异性,可 以得出分子取向重排时间常数,然后根据 Perrin 公式和 Stokes Einstein Debye 公式估算扩散系数、局部黏度以及 分子体积等属性。
在研究蛋白质或分子结合、聚合物聚合, 以及研究其它复杂的溶液或材料中的局域环境时,这些属 性对应着非常重要的信息。例如,通过荧光各向异性,可 以清楚地观察到 BSA 蛋白质去折叠行为的温度依赖性, 如下图所示,这里就利用了本征色氨酸残基的荧光各向异 性
The reaction rates of the binding of thiamine and mercury to form thiachrome found by varying the concentration of thiamine used.
荧光动力学意味着观测荧光强度随着时间的变化,在 此,样品为单一波长的光激发,同时在单一波长位置探测 发射光随时间的变化。有时也使用成对的波长,例如测量 比率计染料或者同时记录基线或背景信息。
如下图所示, 利用基于时间的测量可以跟踪反应速率。借助于 CCD 的 优点,现在也可以获得波长 - 强度 - 时间的三维动力学研 究,相比常规的方法,既可以得到强度随时间的变化,也 可以得到发射波长随时间的变化,这对于动态研究提供了 另一个维度。本例研究的就是,使用不同浓度的硫胺素条 件下,硫胺素与汞结合形成脱氢硫胺素的反应速率。每 一次动力学扫描都代表不同反应速率的脱氢硫胺素形成反 应。
The binding of a fluorophore called ANS to a protein, BSA.
分子间相互作用的荧光动力学测量经常要使用一种快 速混合附件,称为“停流”附件(stopped flow)。停流 可以在几个毫秒的时间内把两种或多种溶液混合在一起, 这样就不受扩散效应影响,在非常接近零混合时间下,记 录分子的结合和反应。
下图给出的是一种叫做 ANS 的荧光基团,与 BSA 蛋 白的结合的例子。ANS 的荧光强度会由于与 BSA 蛋白的 结合而增加,因而可以利用荧光动力学测定二者结合的速 率。本例中,ANS与BSA蛋白结合的速率大约为400毫秒。
有两种附件可以用于控制荧光光度计中样品的温度: 循环水浴和基于珀尔帖效应的半导体制冷器件。
荧光光谱系统的标准样品池支架上有两个端口可以 连接循环水浴制冷,从而使得样品池的温度在 -20° C 至 80° C 范围内可控。另一种替代方法是使用珀尔帖装置控 制的样品池基座,这种方式使得样品池的温度在 -25° C 至105°C范围内可控,并且与水浴相比其温度响应更快速。 二者的不同之处在于,珀尔帖装置能够更精确地控制温度, 相比之下循环水浴系统则往往是先窜到设定温度之上,然 后再降下来。循环水浴系统适合于到达设定温度然后保持 不变进行实验,而珀尔帖温控装置更适合于在一定范围内 多个不同温度点对样品进行测量,或者是测量对温度变化 特别敏感的样品。
此外,还可以选择使用恒温容器和固定工具套装,这 些工具套装适合于不同型号的液氮和液氦恒温容器。除了 制冷之外,大多数恒温器也可以加热至 500K 乃至更高的 温度。
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