Modificações na superfície do SPRi-Biochip (em cerca de 200 nm), como uma interação entre ligantes e analitos, induzem uma mudança nas condições de ressonância, que podem ser medidas.
A ressonância de plasmon de superfície (SPR) é um processo de detecção óptica que ocorre quando a luz polarizada incide sobre um prisma coberto por uma fina camada metálica. Sob certas condições (comprimento de onda, polarização e ângulo de incidência), os elétrons livres na superfície metálica do SPRi-Biochip absorvem os fótons da luz incidente e os convertem em ondas de plasmon de superfície. Essas ondas penetram o meio acima da superfície em uma profundidade de aproximadamente 100 a 200 nm. Em um ângulo de incidência específico (chamado ângulo de ressonância), as ondas de plasmon ressoam com a luz incidente, resultando em uma queda na refletividade. As curvas de plasmon mostram as variações da luz refletida coletada pela câmera em função do ângulo de incidência. A posição do ângulo de ressonância é muito específica para o ambiente local da superfície do SPRi-Biochip.
Modificações na superfície do SPRi-Biochip (em cerca de 200 nm), como uma interação entre ligantes e analitos, induzem uma mudança nas condições de ressonância, que podem ser medidas.
Um plasmon é o fenômeno físico que caracteriza a oscilação do plasma. Mais precisamente, em física, da mesma forma que os fótons são a quantificação das ondas de luz, um plasmon é um quantum de oscilação do plasma. O plasmon é a quasipartícula resultante da quantificação das oscilações do plasma. Assim, os plasmons são oscilações coletivas da densidade do gás de elétrons livres, frequentemente em frequências ópticas. Eles podem se acoplar com um fóton para criar uma terceira quasipartícula chamada polariton de plasma.
Nos plasmons de superfície, em vez de oscilações coletivas de um gás, temos uma oscilação coletiva dos elétrons de condução de um metal. Mais precisamente, os plasmons de superfície são plasmons confinados a superfícies que interagem fortemente com a luz, resultando em um polariton de plasmon de superfície (ou onda de plasmon de superfície).
A imagem da célula de fluxo obtida pelo software corresponde à imagem em tempo real da superfície do SPRi-Biochip. A imagem de diferença mostra os pontos de interação quando a solução analítica é injetada.
A captura de imagens permite o monitoramento simultâneo das condições de ressonância na superfície do SPRi-Biochip. Se o SPRi-Biochip contiver diferentes moléculas imobilizadas (formato de matriz), as interações potenciais nessas diferentes moléculas (também chamadas de ligantes ou pontos) são monitoradas em paralelo, graças ao uso de uma câmera. Essa propriedade (medição simultânea em todos os elementos da matriz) também é frequentemente chamada de multiplexação. O recurso de captura de imagens de nossos dispositivos permite a medição multiplex de até várias centenas de interações.
A imagem da célula de fluxo obtida pelo software corresponde à imagem em tempo real da superfície do SPRi-Biochip. A imagem de diferença mostra os pontos de interação quando a solução analítica é injetada.
Curva de interação cinética: (A) tempo de latência, (B) associação, (C) saturação, (D) dissociação, (E) regeneração.
Quando a solução da amostra é injetada, o analito deve atingir a célula de fluxo para interagir com o ligante. Esse período de tempo em que o analito ainda não está na célula de fluxo é chamado de tempo de latência (A).
Em seguida, a amostra é injetada, os analitos passam pela célula de fluxo e interagem com os ligantes na superfície. Esta etapa é chamada de fase de associação (B). Um platô é atingido (C) ao final da associação, o que pode ser explicado pelos estados moleculares (equilíbrio, saturação ou volume injetado completo). Quando não há mais analitos passando pela célula de fluxo, a solução de analitos é substituída pelo tampão de corrida, e os analitos se dissociam dos ligantes imobilizados; esta é a fase de dissociação (D).
Algumas interações apresentam alta afinidade e alguns analitos podem permanecer ligados aos ligantes mesmo após a etapa de dissociação. Nesse caso, uma solução de regeneração é injetada para remover todos os analitos restantes. Essa é a etapa de regeneração (E). Uma nova solução de amostra pode então ser injetada.
Parâmetros cinéticos
k a é a constante de taxa de associação (M-1.s-1), em alguns casos, também é chamada de k ass k d é a constante de taxa de dissociação (s-1), em alguns casos, também é chamada de k diss.
Os dados cinéticos de SPR (interações) podem ser modelados de forma simples para avaliar a afinidade entre duas moléculas. O modelo geralmente utilizado assume que as reações envolvem um ligante (L) e um analito (A) que interagem numa estequiometria de 1:1:
Este modelo fornece as seguintes fórmulas para nossas curvas cinéticas de interação, uma para a resposta de associação (R a) e outra para a resposta de dissociação (R d), sendo a resposta, em nosso caso, a variação da refletividade:
R a (t)=R eq •(1-exp[-k obs •(tt 0)]) (associação)
R d (t)=R d (t 1) • exp[-k off •(tt 1)] (dissociação)
Com k obs = k ass • C i +k diss, a constante de taxa de associação observada da resposta durante a associação, C i a concentração do analito injetado e k off = k diss, a constante de taxa de dissociação da resposta durante a dissociação, t 0 e t 1 indicam respectivamente o início da associação e da dissociação.
Resumidamente, os parâmetros cinéticos k<sub> ass</sub> e k<sub> diss</sub> são calculados ajustando cada parte da interação (associação e dissociação) a uma curva monoexponencial, preferencialmente utilizando o software ScrubberGen ou EzFit (baseado em Scrubber).
Parâmetros de afinidade
K A é a constante de afinidade (M-1)
K D é a constante de equilíbrio (M)
Conhecendo os parâmetros cinéticos, a constante de afinidade entre duas moléculas pode ser deduzida:
K A = 1/K D = k a /k d
Os parâmetros de afinidade também podem ser calculados a partir de valores de equilíbrio com um ajuste de Langmuir.
Parâmetros termodinâmicos
ΔG é a variação de energia livre.
ΔH é a variação de entalpia.
ΔS é a variação de entropia.
Pode ser calculado a partir da constante de afinidade (ou da constante de dissociação):
ΔG = R • T • ln(K D)
onde R é a constante dos gases, T é a temperatura absoluta (K) e KD é expresso em M.
Para calcular ΔH e ΔS, os parâmetros de afinidade devem ser determinados em diversas temperaturas. ΔG é deduzido desses valores em uma faixa de temperaturas. A equação não linear de Van't Hoff é ajustada aos dados para determinar ΔH e ΔS.
Então, sabendo que ΔG = ΔH-T•ΔS, a variação de entropia também pode ser avaliada.
