Apresentação do instrumento

Comprimentos de onda de laser que variam do ultravioleta ao infravermelho próximo, passando pelo visível, podem ser usados para espectroscopia Raman. Exemplos típicos incluem (mas não se limitam a):

• Ultravioleta: 244 nm, 266 nm, 320 nm, 355 nm, 405 nm
• Visível: 458 nm, 473 nm, 515 nm, 532 nm, 594 nm, 633 nm, 660 nm
• Infravermelho próximo: 785 nm, 830 nm, 980 nm, 1064 nm

A escolha do comprimento de onda do laser tem um impacto importante nas capacidades experimentais:

Sensibilidade

A intensidade do espalhamento Raman é proporcional a ^λ⁻⁴, onde λ é o comprimento de onda do laser. Assim, um laser infravermelho resulta em uma diminuição da intensidade de espalhamento por um fator de 15 ou mais, quando comparado com lasers visíveis azuis/verdes.

Resolução espacial                   

O diâmetro do ponto focal do laser, limitado pela difração, pode ser calculado pela equação diâmetro = 1,22 λ/NA (onde λ é o comprimento de onda do laser e NA é a abertura numérica da objetiva do microscópio utilizada). Por exemplo, com um laser de 532 nm e uma objetiva de 0,90/100x, o diâmetro teórico do ponto focal será de 0,72 µm; com a mesma objetiva, um laser de 785 nm produziria um diâmetro teórico de 1,1 µm. Portanto, a resolução espacial alcançável depende, em parte, da escolha do laser. 

Otimização dos resultados com base no comportamento da amostra

Por exemplo:

• Os lasers azuis ou verdes podem ser adequados para materiais inorgânicos e experimentos de ressonância Raman (por exemplo, para nanotubos de carbono e outros materiais de carbono) e para a dispersão Raman intensificada por superfície (SERS).
• A cor vermelha ou o infravermelho próximo (660-830 nm) são bons para suprimir a fluorescência.
• Lasers ultravioleta para ressonância Raman em biomoléculas (como proteínas, DNA e RNA) e supressão de fluorescência.

Os lasers ultravioleta (UV) para espectroscopia Raman normalmente incluem comprimentos de onda que variam de 244 nm a 355 nm.

Teoricamente, a espectroscopia Raman UV não difere da análise padrão usando comprimentos de onda de laser visíveis. No entanto, na prática, existem diversas dificuldades e desvantagens práticas que devem ser consideradas.

Vantagens

• Com certas amostras, a excitação por laser UV pode interagir de maneiras impossíveis com fontes de laser visíveis. Por exemplo, em materiais semicondutores, a profundidade de penetração da luz UV é tipicamente da ordem de alguns nanômetros, e, portanto, a espectroscopia Raman UV pode ser usada para analisar seletivamente uma fina camada superficial (como é comum em materiais de silício sobre isolante - SOI). Em outro exemplo, a excitação por UV pode gerar um aumento específico da ressonância com moléculas biológicas, particularmente proteínas, DNA e RNA. A análise específica desses materiais em tecidos pode ser difícil usando comprimentos de onda de laser visíveis.

• A supressão da fluorescência pode ser frequentemente auxiliada pelo uso de lasers UV, através da separação espectral dos sinais Raman e de fluorescência. Com lasers visíveis, é comum que os sinais Raman e de fluorescência se sobreponham, e a intensidade incomparável da fluorescência é o que pode perturbar (ou mascarar completamente) o espectro Raman. Com a excitação UV, o espectro Raman fica próximo à linha do laser, enquanto a fluorescência é frequentemente deslocada para comprimentos de onda mais altos. Assim, eles deixam de se sobrepor e a fluorescência deixa de ser um problema.

• O aumento da sensibilidade pode resultar da excitação por UV, uma vez que a eficiência do espalhamento Raman é proporcional a ^λ⁻⁴, onde λ é o comprimento de onda do laser. Assim, o espalhamento Raman a 325 nm é 14 vezes mais eficiente do que a 633 nm.

Desvantagens

• A espectroscopia Raman UV continua sendo uma técnica mais sofisticada que exige maior especialização para ser utilizada. Isso se deve, em parte, ao fato de o feixe de laser ser agora invisível e de os lasers serem maiores, mais complexos e consideravelmente mais caros.

• As amostras ficam mais propensas à queima e à degradação pelo feixe de laser, uma vez que a energia por fóton é aumentada. No entanto, novas técnicas, como a óptica DuoScan™, permitem que o feixe de laser seja varrido rapidamente sobre a amostra, evitando assim a queima imediata. Por exemplo, a celulose queima com excitação de 325 nm em poucos milissegundos, mas com o DuoScan™ ela permanece resistente à queima por mais de cinco minutos.

• Muitos sistemas Raman projetados para análise no visível e infravermelho próximo não são adequados para Raman UV. O Raman UV requer revestimentos de espelho específicos, objetivas de microscópio, grades de difração e um detector CCD para resultados otimizados. Sistemas modernos, como o LabRAM HR, podem ser configurados para funcionar eficientemente desde o ultravioleta até o infravermelho sem comprometer a qualidade, mas, mesmo assim, os requisitos adicionais têm um custo.

Os lasers de infravermelho próximo (NIR) para Raman normalmente incluem uma faixa de comprimentos de onda maiores que 700 nm, como 785 nm, 830 nm, 980 nm e 1064 nm. A principal razão para o uso do Raman NIR é a supressão da fluorescência, mas existem algumas desvantagens que devem ser consideradas. Embora o Raman NIR seja, por vezes, inestimável, certamente não deve ser considerado a melhor solução para todas as amostras.

Vantagens

• A supressão da fluorescência pode ser frequentemente auxiliada pelo uso de lasers NIR. A fluorescência é um processo de dois fótons, que primeiro requer a absorção de um fóton, seguida pela emissão de um fóton fluorescente. Por outro lado, o espalhamento Raman é um processo de espalhamento de um único fóton, que não requer absorção. Embora muitos materiais absorvam na região visível, poucos o fazem na região NIR. Assim, em muitos casos, os lasers NIR não induzem fluorescência (já que não ocorre absorção), mas o espalhamento Raman estará presente normalmente. Em casos onde as amostras apresentam forte fluorescência com excitação visível, o Raman NIR pode ser uma solução, permitindo a obtenção de um bom espectro Raman.

Desvantagens

• A diminuição da sensibilidade pode resultar da excitação no infravermelho próximo (NIR), uma vez que a eficiência do espalhamento Raman é proporcional a ^λ⁻⁴, onde λ é o comprimento de onda do laser. Assim, o espalhamento Raman a 785 nm é quase 5 vezes menos eficiente do que a 532 nm. Esse problema é agravado pela diminuição da sensibilidade do detector CCD na faixa Raman do NIR. Consequentemente, os tempos de medição são frequentemente aumentados consideravelmente para se obter qualidade espectral semelhante à das medições realizadas com lasers visíveis.

• Os lasers NIR frequentemente apresentam características de feixe (por exemplo, largura e divergência do feixe) que não são tão adequadas para microscopia. Consequentemente, a resolução espacial pode ficar comprometida, e os resultados obtidos podem não corresponder às previsões teóricas.

Existem duas classes principais de filtros usados na espectroscopia Raman.

Filtros ópticos

Esses componentes ópticos são colocados no caminho do feixe Raman e são usados para bloquear seletivamente a linha do laser (dispersão Rayleigh), permitindo que a luz dispersa por Raman passe para o espectrômetro e o detector. Cada comprimento de onda do laser requer um filtro individual. Existem dois tipos principais de filtros usados, ambos podendo ser utilizados sem intervenção ou otimização do usuário:

• Filtro de borda. Um filtro de borda é um filtro óptico passa-alta que absorve todos os comprimentos de onda até um determinado ponto e, em seguida, transmite com alta eficiência todos os comprimentos de onda acima desse ponto. Por exemplo, um filtro de borda de 532 nm absorverá toda a luz até 533,5 nm ou acima (por exemplo, 50 ^cm⁻¹ ou acima), incluindo a emissão do laser. Acima de 533,5 nm, ele transmitirá luz, permitindo a detecção do espectro Raman (que se estende de 50 ^cm⁻¹ até 3500 ^cm⁻¹ ou acima). Os filtros de borda possuem uma transição extremamente abrupta entre as regiões espectrais de absorção e transmissão, oferecendo excelente bloqueio da linha do laser. A vantagem do filtro de borda é sua estabilidade ambiental e vida útil praticamente infinita.

• Filtro de entalhe holográfico. Um filtro de entalhe possui uma absorção nítida e discreta que, para espectroscopia Raman, é escolhida para coincidir com um comprimento de onda específico do laser. Tipicamente, a absorção terá alguns nanômetros de largura (correspondendo a algumas centenas de ^cm⁻¹). Como exemplo, para um laser de 532 nm, um filtro de entalhe será escolhido com uma absorção central em 532 nm. A linha do laser será absorvida, mas o espectro Raman acima será transmitido. Ao contrário do filtro de borda, o filtro de entalhe tem uma vida útil finita e se degrada com o tempo. A vantagem do filtro de entalhe é que ele permite a realização de medições tanto para o espalhamento Raman Stokes quanto para o anti-Stokes, o que é útil para certas medições especializadas.

• Espectrômetro de filtragem sintonizável com instrumento de triplo monocromador, é possível trabalhar em modo "dupla subtrativo, espectrógrafo único". Os dois primeiros monocromadores são usados como um par integral, que primeiro dispersa a luz espalhada por Rayleigh (laser) e Raman, bloqueia fisicamente a luz de Rayleigh e, em seguida, recombina a luz. O terceiro espectrômetro atua então da maneira usual, dispersando a luz espalhada por Raman para posterior detecção. A vantagem de usar um espectrômetro triplo dessa forma é que o filtro de laser é infinitamente variável e um único instrumento pode ser usado com qualquer número de fontes de laser. Além disso, o desempenho da filtragem é excelente e permite a análise Raman até 4-5 ^cm⁻¹. No entanto, tal instrumento requer mais experiência para operar em comparação com os sistemas de monocromador único baseados em filtro mais comuns e, portanto, raramente seria considerado para análises de rotina.

Um CCD (Dispositivo de Carga Acoplada) é um detector de matriz multicanal à base de silício para luz ultravioleta, visível e infravermelha próxima. São utilizados em espectroscopia Raman devido à sua extrema sensibilidade à luz (e, portanto, adequados para a análise do sinal Raman, inerentemente fraco) e por permitirem a operação multicanal (o que significa que todo o espectro Raman pode ser detectado em uma única aquisição). Os CCDs são amplamente utilizados, principalmente como sensores em câmeras digitais, mas as versões para espectroscopia científica são de qualidade consideravelmente superior para oferecer a melhor sensibilidade, uniformidade e características de ruído possíveis.

Os detectores CCD são tipicamente matrizes unidimensionais (lineares) ou bidimensionais (de área) com milhares ou milhões de elementos detectores individuais (também conhecidos como pixels). Cada elemento interage com a luz para acumular uma carga – quanto mais brilhante a luz e/ou quanto maior o tempo de interação, maior a carga registrada. Ao final da leitura da medição, os circuitos eletrônicos extraem a carga dos elementos, momento em que cada leitura de carga individual é realizada.

Em um espectrômetro Raman típico, a luz espalhada por Raman é dispersa usando a grade de difração, e essa luz dispersa é então projetada no eixo longitudinal da matriz CCD. O primeiro elemento detectará a luz da extremidade de baixa frequência (^cm⁻¹) do espectro, o segundo elemento detectará a luz da próxima posição espectral e assim por diante... o último elemento detectará a luz da extremidade de alta frequência (^cm⁻¹) do espectro.

Os CCDs requerem algum grau de resfriamento para serem adequados para espectroscopia de alta qualidade. Normalmente, isso é feito usando resfriamento Peltier (adequado para temperaturas de até -90 °C) ou resfriamento criogênico com nitrogênio líquido. A maioria dos sistemas Raman utiliza detectores resfriados por Peltier, mas para certas aplicações especializadas, os detectores resfriados por nitrogênio líquido ainda apresentam vantagens.

Um CCD de multiplicação de elétrons (EMCCD) é um tipo especial de detector CCD que utiliza tecnologia de ponta para aprimorar a qualidade do espectro em situações de sinais extremamente baixos. Esse aprimoramento é particularmente valioso quando o sinal Raman é muito fraco, pois o processo de multiplicação de elétrons pode resultar em espectros de boa qualidade, diferentemente dos CCDs convencionais, nos quais apenas algumas das características mais intensas são visíveis acima do ruído. Os benefícios do ganho EM são evidentes na obtenção de imagens espectrais Raman rápidas, onde os curtos tempos de integração necessários podem resultar em sinais que são quase imperceptíveis acima do ruído quando medidos com um CCD convencional.

O EMCCD possui dois registradores de leitura no chip: um registrador convencional e um registrador de multiplicação de elétrons (EM). No registrador EM, as tensões de clock utilizadas são mais altas do que no clock convencional, fazendo com que os elétrons adquiram energia suficiente para que a ionização por impacto ocorra. Nesse ponto, elétrons extras são produzidos e armazenados no próximo pixel. Há apenas uma pequena probabilidade de os elétrons adquirirem energia suficiente para que a ionização por impacto ocorra (criando, assim, elétrons adicionais), mas como o registrador de leitura possui muitos elementos, fatores de ganho significativos são possíveis (até ~1000x). O principal benefício de um EMCCD é que a amplificação ocorre antes da leitura do sinal, o que significa que o sinal não é limitado pelo ruído de leitura. Em outras palavras, por meio da amplificação, o sinal é elevado bem acima do nível de ruído, que é determinado em grande parte pelo ruído da eletrônica de leitura (pré-amplificador e conversor A/D).

A resolução espectral é a capacidade de separar características e bandas espectrais em seus componentes individuais. A resolução espectral necessária para o analista ou pesquisador depende da aplicação em questão. Por exemplo, análises de rotina para identificação básica de amostras geralmente requerem resolução baixa/média. Em contrapartida, a caracterização de polimorfos e cristalinidade frequentemente exige alta resolução, visto que esses fenômenos apresentam apenas mudanças muito sutis no espectro Raman, que não seriam visíveis em um experimento de baixa resolução.

A resolução espectral é um parâmetro experimental importante. Se a resolução for muito baixa, informações espectrais serão perdidas, impedindo a identificação e caracterização corretas da amostra. Se a resolução for muito alta, o tempo total de medição poderá ser maior do que o necessário. O que torna a resolução "muito baixa" ou "muito alta" depende da aplicação específica e das informações que se deseja obter com o experimento.

Normalmente, uma resolução baixa/média é adequada para a identificação química básica e para distinguir diferentes materiais. Uma resolução mais alta torna-se necessária para caracterizar características espectrais mais sutis – por exemplo, pequenas alterações na forma ou na posição de um pico. Existem diversos fenômenos químicos que causam essas alterações espectrais sutis:

• Cristalinidade– Em geral, os picos Raman tornam-se mais nítidos e intensos à medida que um material passa de uma estrutura amorfa para uma cristalina. A alta resolução espectral permite caracterizar até mesmo pequenas alterações na cristalinidade.

• Polimorfismo– Polimorfos são materiais que possuem a mesma fórmula química, mas diferentes estados sólidos. Como a fórmula química é idêntica, seus perfis espectrais Raman gerais são semelhantes, mas a influência do estado sólido nas vibrações das ligações individuais causa mudanças sutis no espectro. Portanto, não é inesperado observar pequenas alterações nos formatos e posições dos picos ao longo do espectro.

• Tensão/deformação intrínseca– Alguns materiais (principalmente semicondutores) apresentam alterações em seus espectros Raman/fotoluminescência quando submetidos a tensão e deformação. No caso dos semicondutores, a tensão/deformação é cuidadosamente induzida no material para produzir propriedades semicondutoras e/ou luminescentes necessárias para o uso desse material em dispositivos funcionais. A espectroscopia Raman é uma ferramenta essencial para caracterizar a tensão/deformação, mas, frequentemente, o efeito no espectro é sutil – portanto, alta resolução é necessária.

• Ligações de hidrogênio– As interações inter e intramoleculares fracas causadas pelas ligações de hidrogênio podem provocar pequenas alterações no espectro Raman e, com alta resolução, o espectro pode ser usado para investigar essas interações.

• Enovelamento de proteínas– A estrutura primária de uma proteína terá, obviamente, um impacto significativo nos espectros Raman resultantes, mas as estruturas secundária e terciária, que compreendem o enovelamento localizado e mais disseminado, causam perturbações suficientes nos modos vibracionais para afetar o espectro. Mais uma vez, o efeito será sutil e somente análises de alta resolução permitirão sua caracterização.

A resolução espectral em um espectrômetro Raman dispersivo é determinada por quatro fatores principais. Nas discussões a seguir, o efeito de cada fator é considerado sob a suposição de que todos os outros fatores permanecem inalterados. Na prática, todos esses fatores podem existir em diversas combinações, o que dificulta a comparação direta do desempenho e das capacidades de um sistema.

distância focal do espectrômetro

Quanto maior a distância focal (por exemplo, a distância entre a grade de dispersão e o detector) do espectrômetro, maior a resolução espectral. Espectrômetros Raman típicos possuem distâncias focais que variam de 200 mm (para baixa/média resolução) até 800 mm ou mais (para alta resolução). Às vezes, esquece-se que um espectrômetro com longa distância focal não se limita apenas a trabalhos de alta resolução – com uma escolha adequada de grades (veja abaixo), um espectrômetro de alta resolução pode operar em modo de baixa resolução. Dessa forma, ele é ideal para análises de baixa/média resolução em triagens de rotina, e ainda pode oferecer análises de alta resolução para aplicações mais especializadas.

Rede de difração

Quanto maior a densidade de ranhuras da grade (normalmente medida como o número de ranhuras por milímetro), maior a resolução espectral. As grades típicas usadas para Raman variam de cerca de 300 ranhuras/mm (baixa resolução) até 1800 ranhuras/mm (alta resolução). Grades mais especializadas (incluindo 2400 ranhuras/mm e 3600 ranhuras/mm) também estão disponíveis, mas apresentam certas limitações e não devem ser consideradas de uso geral. O uso de grades com maior densidade de ranhuras não pode ser aplicado indefinidamente para aumentar a resolução espectral, uma vez que elas terão limites práticos e físicos fixos, vinculados ao próprio espectrômetro. Assim, as grades fornecem uma maneira inicial de melhorar a resolução, mas, uma vez atingido seu limite, é necessário utilizar um espectrômetro com maior distância focal.

Comprimento de onda do laser

O poder de dispersão de um par grade/espectrômetro geralmente pode ser considerado constante em termos de comprimento de onda. No entanto, os espectros Raman utilizam uma unidade relacionada à energia (deslocamento Raman, ou número de onda, ^cm⁻¹), o que significa que a resolução espectral diminui à medida que a excitação do laser muda do infravermelho para o visível e, finalmente, para o ultravioleta. Por exemplo, se uma grade de 600 linhas/mm for usada com um laser infravermelho, uma grade de 1200 linhas/mm ou 1800 linhas/mm será necessária com um laser verde para atingir uma resolução semelhante.

Detector

A maioria dos sistemas possui um único detector, portanto, na prática, o usuário não tem controle sobre esse fator. No entanto, é importante observar que diferentes detectores podem ser configurados com diferentes tamanhos de pixel. Quanto menor o pixel, maior a resolução espectral alcançável.

Um microscópio Raman combina um espectrômetro Raman com um microscópio óptico padrão. O feixe de laser de excitação é focalizado através do microscópio para criar um microponto com um diâmetro da ordem de 0,5 a 10 µm. O sinal Raman da amostra é coletado de uma área semelhante, passa de volta através do microscópio para o espectrômetro e é analisado para obtenção de informações espectrais.

O microscópio Raman permite realizar espectroscopia Raman com resolução espacial microscópica. Dessa forma, abre-se uma nova dimensão na análise química:

• Análise e identificação de partículas individuais com dimensões de até 0,5 µm.
• Caracterização de elementos da amostra com dimensões de até 0,5 µm.
• Localização e identificação de contaminantes microscópicos.
• Mapeamento Raman (imagem) de características da amostra para mostrar a distribuição de componentes, com resolução espacial de até 0,5 µm.

A simples adição de um microscópio auxilia na obtenção de resolução espacial lateral (XY), mas não fornece resolução espacial de profundidade (Z). Para isso, são necessárias ópticas confocais. Existem diversos métodos em uso atualmente, alguns verdadeiramente confocais, outros pseudoconfocais, que funcionam com diferentes graus de sucesso. Para um projeto verdadeiramente confocal (que incorpora uma abertura confocal totalmente ajustável), é possível obter resolução de profundidade na ordem de micrômetros, permitindo que camadas individuais de uma amostra sejam analisadas discretamente.

Alguns microscópios Raman não possuem óptica confocal. A simples adição de um microscópio auxilia na obtenção de resolução espacial lateral (XY), mas não proporciona resolução espacial em profundidade (Z). Para isso, é necessária óptica confocal. Existem diversos métodos em uso atualmente, alguns verdadeiramente confocais, outros pseudoconfocais, que funcionam com diferentes graus de sucesso. Com um projeto verdadeiramente confocal (que incorpora uma abertura confocal totalmente ajustável), é possível obter resolução em profundidade na ordem de micrômetros, permitindo a análise discreta de camadas individuais de uma amostra.