Espectro Raman da aspirina, tempo de aquisição: 1s
O tempo de aquisição depende de diversos fatores, como a própria amostra, a qualidade espectral desejada e o espectrômetro Raman utilizado. No entanto, os espectrômetros Raman modernos típicos conseguem adquirir espectros Raman de boa qualidade em poucos segundos.
Experimentos de mapeamento/imagem Raman, que adquirem milhares de espectros, levam mais tempo, podendo o tempo total de aquisição variar de alguns minutos a várias horas. Isso depende do número de pontos de dados adquiridos, além dos outros fatores mencionados anteriormente.
Acessório MultiWell para análise de alto rendimento
Como a espectroscopia Raman é uma técnica sem contato e não destrutiva, ela pode ser usada eficazmente para triagem automatizada de alto rendimento (HTS) e medições de ensaios. As aplicações típicas incluem a análise de líquidos/pós em placas de múltiplas cavidades, triagem de cristais e ensaios de conteúdo/uniformidade de comprimidos com Raman de transmissão.
Os sistemas Raman de triagem de alto rendimento (HTS) utilizam uma combinação de movimentação automatizada de amostras, dispositivos de autofoco e procedimentos automatizados de aquisição e análise de dados para obter espectros de centenas de amostras sequencialmente. A triagem HTS e as medições automatizadas podem até ser integradas ao manuseio totalmente automatizado por robôs, eliminando a necessidade de conhecimento especializado e intervenção do operador.
Aplicações como revestimentos de carbono tipo diamante (DLC) para discos rígidos de computador e análises de cristais e polimorfos no desenvolvimento de medicamentos agora utilizam a espectroscopia Raman para triagem automatizada, assim como muitas outras aplicações que simplesmente exigem análises de rotina de um grande número de amostras.
Como a espectroscopia Raman é uma técnica de espalhamento de luz, é possível transmitir tanto a luz de excitação do laser quanto o sinal Raman por meio de cabos de fibra óptica. Um cabo é usado para transmitir o laser até a amostra, enquanto outra fibra é usada para transmitir o sinal Raman da amostra para um espectrômetro e sistema de detecção padrão. Esses dois cabos são conectados a uma cabeça de sonda Raman compacta e robusta, que focaliza o laser na amostra e coleta o sinal Raman.
A geração atual de sondas Raman pode ser usada para amostragem remota a centenas de metros do analisador Raman principal. Além disso, várias sondas podem ser conectadas a um único sistema de análise, proporcionando um método econômico para monitorar a composição química em múltiplos pontos dentro de uma planta.
As sondas são adequadas para uso em altas temperaturas e pressões. Elas podem operar tanto no modo de imersão (onde a cabeça de análise é mergulhada no líquido de reação) quanto no modo à distância (onde a análise é feita focando o laser através de uma janela transparente no recipiente de reação ou na tubulação).
A análise Raman remota pode ser usada para:
Espectros Raman de referência e mapas Raman de diferentes sabões industriais.
A espectroscopia Raman é uma técnica de análise química não destrutiva e sem contato, que pode ser aplicada em análises in vivo. Normalmente, isso é feito usando uma sonda Raman remota compacta, acoplada ao espectrômetro e ao laser por meio de cabos de fibra óptica flexíveis.
Existem muitos exemplos de análises in vivo, particularmente na análise de cosméticos e medicamentos tópicos na pele. Pesquisas atuais investigam a aplicação da espectroscopia Raman in vivo em ambientes cirúrgicos, onde ela pode ser usada como um indicador imediato da saúde do tecido.
A espectroscopia Raman é muito adequada para a análise de amostras aquosas (incluindo soluções e materiais biológicos como tecidos e células). A água apresenta um espalhamento Raman muito fraco, tipicamente muito mais fraco do que outros materiais. Além disso, o espectro da água é muito simples, com apenas um pequeno número de picos, minimizando assim a interferência com os picos do soluto.
Assim, a análise de um soluto em solução aquosa é facilmente possível, uma vez que, na maioria dos casos, a intensidade do pico do soluto será maior do que a da água, mesmo quando a água estiver em grande excesso.
O tamanho do ponto do laser é definido principalmente pelo comprimento de onda do laser e pela objetiva do microscópio utilizada. O tamanho mínimo do ponto que pode ser alcançado é limitado pela difração, de acordo com as leis da física e da óptica.
Diâmetro do ponto laser = 1,22 λ/NA
onde λ é o comprimento de onda do laser e NA é a abertura numérica da objetiva do microscópio utilizada. Por exemplo, com um laser de 532 nm e uma objetiva de 0,90/100x, o diâmetro teórico do ponto focal será de 721 nm.
A partir dessa equação, pode-se observar que lasers de comprimento de onda mais curto oferecem maior resolução espacial (por exemplo, um laser azul de 488 nm terá um ponto focal menor do que um laser infravermelho de 785 nm se a mesma objetiva for usada), assim como objetivas de alta abertura numérica (por exemplo, uma objetiva de 0,90/100x produzirá um ponto focal menor do que uma objetiva de 0,55/50x).
Uma equação ligeiramente modificada fornece a resolução espacial teórica limitada pela difração, que pode ser alcançada usando um microscópio óptico:
Resolução espacial = 0,61 λ / NA
Para um laser de 532 nm com uma objetiva de 0,90/100x, isso preveria uma resolução espacial de 361 nm. No entanto, embora essa equação seja aplicável à microscopia óptica padrão, os processos ópticos que ocorrem durante a microscopia Raman são muito mais complexos. Por exemplo, a dispersão dos fótons do laser/Raman e a interação com as interfaces da amostra podem reduzir essa resolução. Assim, a resolução espacial típica da microscopia Raman é frequentemente citada como sendo da ordem de 1 µm, enquanto que, com amostras de boa qualidade, é possível alcançar uma resolução espacial próxima ao limite de difração.
Alguns sistemas, como o LabRAM HR, podem ser configurados com óptica adaptativa, como o DuoScan™, que permite a criação de pontos de laser com dimensões de até 270 x 270 µm² (dependendo da objetiva utilizada).
Os microscópios Raman padrão são limitados a tamanhos de ponto na ordem de 0,5 a 10 µm (dependendo do comprimento de onda do laser e da objetiva utilizada), devido ao caminho óptico do feixe de laser colimado através da objetiva. Embora esses pequenos tamanhos de ponto sejam ideais para a análise de características microscópicas e ofereçam excelente resolução espacial quando combinados com óptica confocal verdadeira, eles podem ser limitados para análises macroscópicas ou em larga escala.
Resolução espacial de um microscópio Raman: Imagem 3D de filme de mascaramento laminado de polímero
A resolução espacial alcançável é definida principalmente pelo comprimento de onda do laser e pela objetiva do microscópio utilizada. A resolução espacial teórica limitada pela difração, de acordo com as leis da física e da óptica, é definida pela seguinte equação:
Resolução espacial = 0,61 λ / NA
onde λ é o comprimento de onda do laser e NA é a abertura numérica da objetiva do microscópio que está sendo utilizada.
Para um laser de 532 nm com uma objetiva de 0,90/100x, isso preveria uma resolução espacial de 361 nm. No entanto, embora essa equação seja aplicável à microscopia óptica padrão, os processos ópticos que ocorrem durante a microscopia Raman são muito mais complexos. Por exemplo, a dispersão dos fótons do laser/Raman e a interação com as interfaces da amostra podem reduzir essa resolução. Assim, a resolução espacial típica da microscopia Raman é frequentemente citada como sendo da ordem de 1 µm, enquanto que, com amostras de boa qualidade, é possível alcançar uma resolução espacial próxima ao limite de difração.
A partir dessa equação, pode-se observar que lasers de comprimento de onda mais curto oferecem maior resolução espacial (por exemplo, um laser azul de 488 nm terá um ponto focal menor do que um laser infravermelho de 785 nm se a mesma objetiva for usada), assim como objetivas de alta abertura numérica (por exemplo, uma objetiva de 0,90/100x produzirá um ponto focal menor do que uma objetiva de 0,55/50x).
Resolução espacial de um microscópio Raman: mapeamento Raman de características semicondutoras de 250 nm e 350 nm.
Note que a equação acima se refere à resolução espacial lateral (XY). A resolução espacial em profundidade (Z) é mais complexa e depende fortemente do design confocal do microscópio Raman utilizado. Existem vários métodos em uso atualmente, alguns verdadeiramente confocais, outros pseudoconfocais, que funcionam com diferentes graus de sucesso.
Para um design confocal verdadeiro (que incorpora uma abertura de orifício confocal totalmente ajustável), é possível obter uma resolução de profundidade da ordem de 1 a 2 µm, permitindo que camadas individuais de uma amostra sejam analisadas discretamente. A resolução de profundidade alcançável dependerá fortemente do comprimento de onda do laser, da objetiva do microscópio e da estrutura da amostra.
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