A microscopia confocal Raman refere-se à capacidade de filtrar espacialmente o volume de análise da amostra, nos eixos XY (lateral) e Z (profundidade).
A microscopia Raman acopla um espectrômetro Raman a um microscópio óptico padrão, permitindo a visualização de uma amostra com alta ampliação e a análise Raman com um ponto de laser microscópico. A microscopia Raman é simples: basta colocar a amostra sob o microscópio, focar e fazer a medição.
A simples adição de um microscópio a um espectrômetro Raman não proporciona um volume de amostragem controlado; para isso, é necessário um filtro espacial. A microscopia Raman confocal refere-se à capacidade de filtrar espacialmente o volume de análise da amostra nos eixos XY (lateral) e Z (profundidade).
Existem vários métodos em uso atualmente (por exemplo, abertura confocal verdadeira ou técnicas de agrupamento de fendas pseudoconfocais), e alguns são melhores que outros. No entanto, está bem estabelecido que, usando um microscópio Raman confocal verdadeiro, é possível analisar partículas ou camadas individuais com dimensões de até 1 µm ou menos.
Para um projeto confocal verdadeiro, a resolução espacial típica é da ordem de 0,5 a 1 µm.
Para um verdadeiro projeto confocal, os limites da resolução espacial são definidos principalmente pelo comprimento de onda do laser e pela qualidade do feixe de laser utilizado, bem como pelo tipo de objetiva do microscópio selecionada, entre outros fatores. Para a resolução espacial mais alta, uma objetiva de alta magnificação corretamente combinada com excitação a laser visível geralmente produz resultados ótimos. A resolução espacial típica está na ordem de 0,5 a 1 µm.
Como o próprio nome sugere, a análise Raman remota in situ é um método de análise de uma amostra in situ e/ou em um local remoto, em vez de ter que extrair parte da amostra e levá-la a um espectrômetro Raman. É frequentemente utilizada em ambientes industriais, onde exemplos incluem o monitoramento de componentes de reação em um reator (desde um pequeno frasco de vidro até reatores de escala industrial) e a análise de substâncias químicas em múltiplos pontos de tubulações.
A espectroscopia Raman remota in situ é frequentemente realizada utilizando fibras ópticas, permitindo que uma sonda Raman seja acoplada a um espectrômetro (que pode estar a centenas de metros do ponto de análise). Um único cabo é usado para transmitir o laser até a amostra, enquanto outra fibra é utilizada para transferir o sinal Raman da amostra para um espectrômetro e sistema de detecção padrão. Esses dois cabos são conectados a uma sonda Raman compacta e robusta que focaliza o laser na amostra e coleta o sinal Raman.
As sondas são adequadas para uso em altas temperaturas e pressões. Elas podem operar tanto no modo de imersão (onde a cabeça de análise é mergulhada no líquido de reação) quanto no modo à distância (onde a análise é feita focando o laser através de uma janela transparente no recipiente de reação ou na tubulação).
A análise Raman in situ pode ser usada para:
A espectroscopia Raman por transmissão (ou TRS) é uma forma de análise Raman ideal para a análise em massa de materiais opacos/turvos.
A espectroscopia Raman por transmissão (ou TRS) é uma forma de análise Raman ideal para a análise de materiais opacos/turvos em grande escala. A espectroscopia Raman por transmissão baseia-se na coleta da luz Raman que se propaga através da amostra na direção do laser de excitação – em essência, a amostra é iluminada com o laser de excitação de um lado e o sinal Raman é coletado do outro.
Apesar da amostra ser opaca, a luz do laser consegue atravessá-la por meio de processos de dispersão. Muitos desses fótons contêm informações Raman, possibilitando assim a espectroscopia Raman de transmissão.
Diferentemente dos espectrômetros Raman e sistemas de microscopia tradicionais, a geometria de transmissão permite uma análise completa do volume total da amostra (por exemplo, um comprimido farmacêutico).
A espectroscopia Raman por transmissão é sem contato, não invasivo e não destrutivo. Não requer preparação da amostra. É importante ressaltar que a medição é insensível aos efeitos do tamanho das partículas, à homogeneidade e à orientação da amostra.
A espectroscopia Raman de transmissão pode ser usada para compreender:
A espectroscopia Raman de ressonância é uma variante da espectroscopia Raman "normal". A espectroscopia Raman "normal" utiliza excitação a laser em qualquer comprimento de onda para medir o espalhamento Raman dessa luz laser.
Apesar dos muitos problemas práticos causados pelo uso de diferentes comprimentos de onda de laser, o resultado final será muito semelhante, independentemente do comprimento de onda utilizado.
Na espectroscopia Raman ressonante, o comprimento de onda de excitação é cuidadosamente escolhido para coincidir com (ou estar muito próximo de) uma transição eletrônica – tipicamente em uma região de absorção UV-visível. Essa sobreposição pode resultar em intensidades de espalhamento aumentadas por fatores de 10² a 10⁶ – assim, os limites de detecção e os tempos de medição podem ser significativamente melhorados. No entanto, como a excitação coincide com a absorção UV-visível, os ruídos de fundo da fluorescência podem ser significativos e mais problemáticos do que no espalhamento Raman "normal".
Uma abordagem alternativa é a Espectroscopia Raman Amplificada por Superfície (SERS), que oferece aumentos de intensidade da mesma ordem de grandeza. A vantagem da SERS sobre a espectroscopia Raman de ressonância é que a fluorescência é suprimida enquanto o sinal Raman é amplificado, eliminando assim o problema do ruído de fundo da fluorescência na espectroscopia Raman de ressonância.
Para certas aplicações específicas, os benefícios da espectroscopia Raman de ressonância podem ser significativos. Um exemplo disso é o uso dessa técnica na análise de poluentes ambientais, onde concentrações na faixa de partes por bilhão (ppb) e partes por milhão (ppm) podem ser detectadas.
Na prática, a espectroscopia Raman de ressonância pode ser explorada em qualquer sistema Raman, e a medição propriamente dita é feita da maneira padrão. O requisito óbvio é ter uma excitação a laser adequada para atender às condições de ressonância.
A configuração de transmissão permite o uso de objetivas com a maior abertura numérica (AN) possível (incluindo objetivas de imersão). A configuração de reflexão pode ser usada para qualquer tipo de amostra (opaca ou transparente), mas é limitada a objetivas com menor AN.
TERS (Espectroscopia Raman com Ponta Aprimorada) leva a espectroscopia Raman para a geração de imagens com resolução nanométrica. TERS é uma técnica química de super-resolução. Melhor ainda, é uma técnica de imagem de super-resolução sem marcadores, que foi expandida por nossa tecnologia inovadora, tornando-se uma importante nova tecnologia de imagem.
A imagem TERS é realizada com um sistema AFM/Raman, onde um microscópio de varredura por sonda (SPM, que pode ser usado nos modos de força atômica, tunelamento por varredura ou força normal/de cisalhamento) é integrado a um espectrômetro Raman confocal por meio de um acoplamento optomecânico. O microscópio de varredura por sonda permite a obtenção de imagens em nanoescala, o acoplamento óptico leva o laser de excitação até a ponta (ou sonda) funcionalizada e o espectrômetro analisa a luz Raman (ou outra luz espalhada), fornecendo uma imagem hiperespectral com contraste químico em escala nanométrica.
Um sistema TERS baseia-se numa ponta metálica (geralmente feita de ouro ou prata) utilizada para concentrar o campo de luz incidente no ápice. A ponta atua como uma nano-fonte de luz e intensificadora de campo local, melhorando significativamente a sensibilidade Raman (por um fator de 10³–10⁷) e reduzindo o volume analisado à região “nano” imediatamente abaixo da ponta. O acoplamento óptico que combina os dois instrumentos utiliza um esquema confocal. Existem duas configurações diferentes para este acoplamento: uma em transmissão e outra em reflexão (Fig. 28), cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens.
A configuração de transmissão permite o uso de objetivas com a maior abertura numérica (AN) possível (incluindo objetivas de imersão), proporcionando alta densidade de potência no ponto focal e possibilitando a coleta de sinais de alta intensidade, mas só pode ser utilizada para amostras transparentes. A configuração de reflexão pode ser usada para qualquer tipo de amostra (opaca ou transparente), porém é limitada a objetivas com menor AN.
Combinando a varredura ponto a ponto com a aquisição simultânea do espectro, é possível realizar mapeamentos Raman de campo próximo com resolução lateral de até dez nanômetros ou menos.
Dispositivos de transmissão Raman para aplicações farmacêuticas estão disponíveis em locais fora dos Estados Unidos da América, Europa e Índia.
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