O que é fluorescência raciométrica?

A fluorescência ratiométrica é um método no qual as intensidades em dois ou mais comprimentos de onda de um espectro de excitação ou emissão são medidas para detectar alterações no ambiente local. Normalmente, utiliza-se uma sonda especificamente sensível a um parâmetro ambiental, como concentração iônica, pH, viscosidade ou polaridade.

A aplicação de corantes ratiométricos para encontrar propriedades sensíveis a sondas, como a concentração de íons, pode ser feita medindo espectros ou cinética.

No espectro de Fura-2, é possível observar que a excitação da fluorescência apresenta dois picos que refletem diretamente a ligação do cálcio iônico livre em solução. Em altas concentrações de cálcio iônico livre, o pico de excitação em 340 nm é comparativamente alto. Quando a concentração de cálcio iônico livre é baixa, o pico de excitação em 380 nm aumenta em relação ao pico em 340 nm.

A razão entre as intensidades em dois comprimentos de onda de excitação, obtidas a partir desses picos, correlaciona-se diretamente com a concentração intracelular de cálcio iônico livre. Medir a razão da fluorescência a 510 nm, quando excitada a 340 nm e 380 nm, ao longo do tempo, fornece um gráfico temporal da variação da concentração de cátions de cálcio em uma solução. A captação celular de cálcio iônico livre é medida dessa maneira.

Existem outras sondas cujos espectros de fluorescência variam da mesma forma com propriedades físicas como a polaridade do solvente, o pH e as concentrações de outros íons, como sódio, potássio e magnésio.

Aqui está um gráfico da razão, indicando a resposta do cálcio intracelular de uma célula atrial carregada com Fura-2. Ao calcular a razão entre as duas intensidades ao longo do tempo, a concentração de íons de cálcio pode ser diretamente correlacionada a essa curva cinética.