A espectroscopia de fluorescência é um método de investigação baseado nas propriedades de fluorescência da amostra em estudo, sendo utilizada para medições quantitativas de produtos químicos.
A espectroscopia de fluorescência analisa a fluorescência de uma molécula com base em suas propriedades fluorescentes.
A fluorescência é um tipo de luminescência causada por fótons que excitam uma molécula, elevando-a a um estado eletrônico excitado.
A espectroscopia de fluorescência utiliza um feixe de luz que excita os elétrons nas moléculas de certos compostos, fazendo com que elas emitam luz. Essa luz é direcionada para um filtro e, em seguida, para um detector, para medição e identificação da molécula ou de alterações na molécula.
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O termo fluorescência refere-se a um tipo de luminescência. Luminescência, em termos gerais, é a emissão de luz por uma molécula. Existem diversos tipos de luminescência.
A fotoluminescência ocorre quando a energia luminosa, ou fótons, estimula a emissão de um fóton.
A quimioluminescência é definida como a ocorrência de um fenômeno em que a energia química estimula a emissão de um fóton, incluindo a bioluminescência, como a observada em vaga-lumes e em diversas formas de vida marinha.
A eletroluminescência ocorre quando a energia elétrica ou um campo elétrico forte estimula a emissão de um fóton, como em algumas aplicações de iluminação.
A fluorescência, especificamente, é um tipo de fotoluminescência em que a luz eleva um elétron a um estado excitado. O estado excitado sofre rápida perda de energia térmica para o ambiente por meio de vibrações e, em seguida, um fóton é emitido do estado excitado singleto de menor energia. Esse processo de emissão de fótons compete com outros processos não radiativos, incluindo transferência de energia e perda de calor.
Quando se utiliza o termo "fluorescência", os mesmos métodos de medição podem normalmente ser aplicados a qualquer uma das categorias de luminescência acima mencionadas.
Os espectros de emissão e excitação de um dado fluoróforo são imagens especulares um do outro.
Os espectros de fluorescência em estado estacionário ocorrem quando moléculas, excitadas por uma fonte constante de luz, emitem fluorescência, e os fótons emitidos, ou intensidade, são detectados em função do comprimento de onda. Um espectro de emissão de fluorescência é obtido quando o comprimento de onda de excitação é fixo e o comprimento de onda de emissão é variado para gerar um gráfico da intensidade em função do comprimento de onda de emissão.
Um espectro de excitação de fluorescência é obtido quando o comprimento de onda de emissão é fixo e o comprimento de onda do monocromador de excitação é varrido. Dessa forma, o espectro fornece informações sobre os comprimentos de onda nos quais uma amostra absorverá para emitir no comprimento de onda de emissão escolhido para observação. É análogo ao espectro de absorbância, mas é uma técnica muito mais sensível em termos de limites de detecção e especificidade molecular. Os espectros de excitação são específicos para um único comprimento de onda/espécie emissora, ao contrário de um espectro de absorbância, que mede todas as espécies absorventes em uma solução ou amostra. Os espectros de emissão e excitação para um determinado fluoróforo são imagens especulares um do outro. Tipicamente, o espectro de emissão ocorre em comprimentos de onda mais altos (menor energia) do que o espectro de excitação ou de absorbância.
Esses dois tipos espectrais (emissão e excitação) são usados para observar como uma amostra está se alterando. A intensidade espectral e/ou o comprimento de onda do pico podem mudar com variáveis como temperatura, concentração ou interações com outras moléculas ao redor. Isso inclui moléculas de extinção e moléculas ou materiais que envolvem transferência de energia. Alguns fluoróforos também são sensíveis às propriedades do meio solvente, como pH, polaridade e certas concentrações iônicas.
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Espectros de emissão de fluorescência de alguns fluoróforos comuns no espectro UV e visível.
Moléculas e materiais fluorescentes vêm em todos os formatos e tamanhos. Alguns são intrinsecamente fluorescentes, como a clorofila e os resíduos de aminoácidos triptofano (Trp), fenilalanina (Phe) e tirosina (Tyr). Outros são moléculas sintetizadas especificamente como corantes orgânicos estáveis ou marcadores para serem adicionados a sistemas que, de outra forma, não seriam fluorescentes. Existem catálogos inteiros disponíveis desses materiais. Tipicamente, as moléculas fluorescentes orgânicas possuem anéis aromáticos e elétrons π-conjugados. Dependendo de seu tamanho e estrutura, os corantes orgânicos podem emitir luz desde o ultravioleta até o infravermelho próximo.
Aqui está uma amostra aleatória de alguns fluoróforos comuns que abrangem a faixa do ultravioleta e do visível. Alguns elementos de terras raras, ou lantanídeos, possuem orbitais eletrônicos superiores preenchidos, onde a transição de elétrons devido à transferência de carga entre o metal e o ligante ocorre entre os orbitais 4f-5d e até mesmo entre os orbitais 4f-4f. (Bunzli, 1989) Existem muitas moléculas que são luminescentes na natureza, como alguns aminoácidos, clorofilas e pigmentos naturais. Outras são altamente projetadas para usos muito específicos da espectroscopia de fluorescência.
Algumas das categorias de moléculas e materiais fluorescentes são:
Outras moléculas e materiais, como proteínas fluorescentes, semicondutores, fósforos e elementos de terras raras, estão entre as amostras fluorescentes comumente utilizadas. Polímeros com aromáticos conjugados ou dienos também costumam apresentar propriedades fluorescentes. Naturalmente, novos materiais são criados o tempo todo.
Para obter o livro mais completo sobre Espectroscopia de Fluorescência, leia o livro do Dr. Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, terceira edição.
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