O que é anisotropia de fluorescência ou polarização de fluorescência?

A anisotropia de fluorescência, ou polarização de fluorescência, é uma medida da mudança de orientação de uma molécula no espaço, em relação ao intervalo de tempo entre os eventos de absorção e emissão. A absorção e a emissão indicam o alinhamento espacial dos dipolos da molécula em relação ao vetor elétrico da onda eletromagnética de excitação e da luz emitida, respectivamente. Em outras palavras, se a população de fluoróforos for excitada com luz polarizada verticalmente, a luz emitida reterá parte dessa polarização, dependendo da velocidade de rotação da molécula na solução. Quanto mais rápido o movimento de orientação, mais despolarizada será a luz emitida. Quanto mais lento o movimento, mais a luz emitida retém a polarização.

Para utilizar essa informação, polarizadores são colocados no caminho da luz de excitação e no caminho da luz de emissão de um fluorômetro. A anisotropia é calculada pela razão entre as intensidades na equação acima, onde IVV indica a intensidade com excitação polarizada verticalmente e polarização vertical na emissão detectada. IVH indica a intensidade quando se utiliza um polarizador vertical na excitação e um polarizador horizontal na emissão. G é um fator de grade usado como correção para a transmissão diferencial do instrumento entre as duas orientações vetoriais ortogonais.

Como funciona o experimento? Primeiro, a fluorescência é medida com o polarizador de excitação e o polarizador de emissão posicionados verticalmente. A intensidade é então inserida na equação de anisotropia como IVV. Em seguida, a medição é repetida com o polarizador de emissão posicionado horizontalmente e a intensidade é inserida na equação como IVH.

A fórmula de anisotropia contém um fator de 2 porque existem duas orientações ortogonais nas quais a deflexão do vetor VVz pode ser projetada, Hx e Hy, resultando em dois componentes IVH.

Uma expressão relacionada, o grau de polarização p, é frequentemente usada para descrever um parâmetro de polarização bidimensional com apenas uma componente horizontal considerada. Neste último caso, a fórmula não teria o multiplicador 2 para IVH, com p substituindo r.

Em seguida, o fator G é calculado medindo-se a intensidade em HH e HV… e inserindo IHV e IHH na equação para G. A anisotropia, denotada por “r” minúsculo, é frequentemente usada como um indicador de tamanho molecular, difusão e viscosidade.

Apresentamos aqui algumas equações úteis para analisar resultados de anisotropia. A equação básica de anisotropia já foi discutida, mas a mesma pode ser calculada para decaimentos de fluorescência completos, fornecendo a anisotropia resolvida no tempo. A partir da anisotropia resolvida no tempo, é possível obter as constantes de tempo de reorientação e, em seguida, usar a equação de Perrin e a equação de Stokes-Einstein-Debye para estimar propriedades como coeficiente de difusão, viscosidade local e volumes moleculares.

Esses dados correspondem a informações muito importantes ao se analisar aplicações como ligação de proteínas ou moléculas, agregação de polímeros e outros estudos de ambiente local em soluções e materiais complexos.

Como exemplo, é possível observar claramente o comportamento de desdobramento da proteína BSA dependente da temperatura, medido por anisotropia de fluorescência. Nesse caso, utiliza-se a anisotropia dos resíduos intrínsecos de triptofano.

A cinética de fluorescência refere-se à observação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Nesse processo, uma amostra é excitada em um único comprimento de onda e a emissão é detectada nesse mesmo comprimento de onda ao longo do tempo. Às vezes, pares de comprimentos de onda são usados para corantes ratiométricos ou para registrar simultaneamente informações de linha de base ou de fundo.

As taxas de reação podem ser acompanhadas usando medições baseadas no tempo, como você pode ver aqui. Neste exemplo, as taxas de reação da ligação da tiamina e do mercúrio para formar o tiacromo são determinadas variando-se a concentração de tiamina utilizada. Cada varredura cinética representa uma taxa de reação diferente da reação de formação do tiacromo.

A cinética da fluorescência é frequentemente medida usando um acessório de mistura rápida chamado fluxo interrompido. O fluxo interrompido mistura duas ou mais soluções em poucos milissegundos, de modo que a ligação ou reação possa ser registrada mais próximo do tempo de mistura zero, sem os efeitos da difusão.

Aqui é mostrada a ligação de um fluoróforo chamado ANS a uma proteína, a BSA. A fluorescência do ANS aumenta após a ligação, portanto, a taxa de ligação pode ser medida usando a cinética de fluorescência. Neste exemplo, a ligação do ANS à BSA ocorre a uma taxa de aproximadamente 400 milissegundos.

Banhos de circulação e controladores de temperatura Peltier são dois acessórios que permitem controlar a temperatura de uma amostra em um fluorômetro. Os suportes de cubeta "padrão" em sistemas de fluorômetro possuem duas conexões para permitir a circulação de líquido, que podem ser conectadas a um banho de água com recirculação. Isso possibilita a regulação de temperaturas na faixa de -40 °C a 70 °C.

Um método alternativo é usar um suporte de células controlado por Peltier, que tem uma resposta mais rápida do que um banho-maria e permite regular temperaturas na faixa de -25 °C a 105 °C. A diferença é que um dispositivo Peltier controla a temperatura com muito mais precisão do que um sistema de recirculação, que tende a subir rapidamente até uma determinada temperatura, ultrapassá-la e retornar até que a temperatura seja atingida.

Banhos de circulação são úteis quando se precisa definir e manter uma temperatura constante durante um experimento, mas para medir amostras em diferentes temperaturas ao longo de uma faixa, ou para amostras muito sensíveis a variações de temperatura, um controlador de temperatura Peltier é uma opção mais prática. Também é possível utilizar criostatos e kits de montagem disponíveis para diferentes modelos de criostatos de nitrogênio líquido e hélio. Além do resfriamento, a maioria dos criostatos também pode aquecer amostras a 500 K ou mais.