Uma matriz de excitação-emissão (EEM) típica
Uma medida que vem sendo cada vez mais utilizada no campo da espectroscopia de fluorescência é a matriz de excitação-emissão, ou EEM. Uma EEM é uma varredura 3D que resulta em um gráfico de contorno do comprimento de onda de excitação versus comprimento de onda de emissão versus intensidade de fluorescência. As EEMs são utilizadas em diversas aplicações que requerem análise multicomponente e são frequentemente consideradas como uma espécie de "impressão digital molecular" para muitos tipos diferentes de amostras.
Algumas das primeiras utilizações publicadas da espectroscopia EEM datam da década de 1980, quando a técnica foi usada para estudar a fluorescência do triptofano em lipoproteínas de baixa densidade no soro sanguíneo humano (Koller, 1986) e para investigar componentes fluorescentes no plasma humano de pacientes com tumores (Leiner, 1986).
Os fluorômetros de varredura tradicionais não permitem o pleno aproveitamento da capacidade de identificação molecular por EEM devido a três limitações fundamentais. Em primeiro lugar, espectrofluorímetros de varredura tradicionais não conseguem compensar inerentemente as variações na concentração das moléculas fluorescentes na amostra. O efeito de filtro interno (EFI) é um fenômeno bem conhecido que distorce o espectro de fluorescência medido de uma molécula devido à absorção que ocorre em concentrações mais elevadas da amostra (tipicamente acima de 0,1 a 0,2 unidades de absorbância). A única maneira de corrigir o EFI com um fluorômetro tradicional é adquirir uma segunda medição em um espectrômetro de absorbância diferente e ajustar o sinal de fluorescência medido de acordo. Mas isso também é muito complicado, pois a medição não ocorre simultaneamente e com os mesmos volumes exatos. Portanto, os fluorômetros de varredura tradicionais não possuem verdadeira independência de concentração, limitando severamente a capacidade de um EEM tradicional de identificar com precisão muitas amostras.
Em segundo lugar, como os fluorômetros, por definição, medem a fluorescência, eles não fornecem informações importantes sobre a absorbância e a cor de todas as moléculas não fluorescentes, o que pode ser crucial para uma identificação molecular multicomponente abrangente.
Um desenvolvimento recente, a aquisição simultânea de espectros de absorção, transmissão e fluorescência (A-TEEM), está disponível em dois espectrofluorímetros HORIBA e resolve muitos dos problemas descritos acima, corrigindo o efeito de filtro interno em tempo real. Como as medições são feitas simultaneamente, não há variações de concentração.
Por fim, os instrumentos de varredura de canal único são muito lentos, exigindo vários minutos a uma hora para coletar um conjunto completo de dados. Portanto, os fluorômetros de varredura são limitados à quantidade de dados EEM que podem coletar em um dia e também ao trabalho apenas com amostras que não sofrem alterações durante o tempo de aquisição do EEM.
A precisão da fluorescência EEM, sem correção IFE, é limitada a amostras com concentrações de absorbância inferiores a cerca de 0,1-0,2. Para acessar o verdadeiro potencial da fluorescência EEM, é necessário empregar métodos de software multivariados, como Análise de Componentes Principais (PCA), Método dos Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) e Análise de Fatores Paralelos (PARAFAC).
O efeito de filtro interno
O efeito de filtro interno é composto por dois processos: o Efeito de Filtro Primário (EFP), onde a intensidade da luz de excitação é gradualmente diminuída devido à absorção em função do comprimento do percurso óptico da amostra líquida antes de atingir o volume fluorescente, e o Efeito de Filtro Secundário (EFS), onde a intensidade da fluorescência emitida é diminuída devido à reabsorção, mesmo pela porção da amostra que não é excitada diretamente pelo feixe de excitação.
Consequência espectral do efeito de filtro interno
Os EEMs são cada vez mais utilizados para a análise da qualidade da água, especificamente para o estudo da matéria orgânica dissolvida cromofórica, também chamada de CDOM. A matéria orgânica dissolvida inclui aminoácidos, ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e outros exemplos de matéria decomposta em fontes de água naturais ou subprodutos da desinfecção em processos de tratamento de água.
Os EEMs são usados para identificar a presença de cada substância em concentrações muito baixas, tipicamente na faixa de ppb. Idealmente, a instrumentação para essa aplicação mede simultaneamente os espectros de fluorescência e a absorbância.
Como a fluorescência é linear com a concentração apenas em valores de absorbância inferiores a cerca de 0,1-0,2, amostras com absorbância mais alta devem ter sua intensidade de fluorescência corrigida para efeitos de filtro interno por meio da medição e aplicação do espectro de absorbância UV-visível.
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