O que é uma medição de fluorescência?

A maioria das moléculas ocupa o estado de energia mais baixo à temperatura ambiente, conhecido como estado fundamental. Dentro desse estado fundamental existem níveis vibracionais. Antes de se tornarem excitadas, muitas moléculas ocupam o nível vibracional mais baixo.

O fóton absorvido faz com que a molécula adote um estado de energia vibracional mais elevado quando absorve um determinado comprimento de onda de luz. As moléculas colidem então com outras moléculas, perdendo sua energia vibracional e retornando ao nível vibracional mais baixo do estado excitado. A molécula pode então retornar aos níveis vibracionais do estado fundamental.

Quando a molécula retorna ao estado fundamental, ela emite um fóton de luz em um comprimento de onda diferente do comprimento de onda que a excitou. É nesse momento que a molécula exibe fluorescência. (Veja o Diagrama de Jablonski)

A fluorescência pode ser medida por fluorômetros. Um fluorômetro é um instrumento projetado para medir os diversos parâmetros da fluorescência, incluindo sua intensidade e distribuição de comprimento de onda da emissão após a excitação. Os químicos utilizam essa técnica para identificar propriedades e a quantidade de moléculas específicas em uma amostra.

Os químicos chamam de fluoróforos as moléculas que podem exibir fluorescência.

Os cientistas usam espectrômetros de fluorescência para excitar moléculas de fluoróforos e medir a fluorescência emitida. O espectrômetro introduz luz ultravioleta ou visível usando uma fonte de fótons, como um laser, uma lâmpada de xenônio ou LEDs. A luz passa por um monocromador que seleciona um comprimento de onda específico, geralmente usando uma grade de difração. Uma grade de difração é uma placa de vidro ou metal com linhas paralelas muito próximas, produzindo um espectro por difração e interferência da luz. A luz que sai emerge em um ângulo específico, dependendo do seu comprimento de onda.

O espectrômetro focaliza o comprimento de onda monocromático em direção à amostra. A amostra emite um comprimento de onda que se propaga até o detector. O detector geralmente é posicionado em um ângulo de 90 graus em relação à fonte de luz para evitar qualquer interferência da luz de excitação transmitida.

Os fótons emitidos atingem um fotodetector. Um software conectado ao detector gera um espectro, uma representação gráfica que mostra quais comprimentos de onda a amostra absorve.

O espectro de emissão mostra quais comprimentos de onda as amostras emitem.