A fluorescência é um tipo de luminescência causada por fótons que excitam uma molécula, elevando-a a um estado eletrônico excitado. Ela ocorre pela absorção de fótons no estado fundamental singleto, que é promovido a um estado excitado singleto. Quando a molécula excitada retorna ao estado fundamental, emite um fóton de menor energia, que corresponde a um comprimento de onda maior, do que o fóton absorvido.
A espectroscopia de fluorescência analisa a fluorescência de uma molécula com base em suas propriedades fluorescentes. A fluorescência é um tipo de luminescência causada por fótons que excitam uma molécula, elevando-a a um estado eletrônico excitado.
Figura 3: Diagrama de Jablonski da absorbância molecular e da fluorescência.
A Figura 3 mostra o diagrama de Jablonski (Jablonski, 1933), um esquema da transição do estado eletrônico de uma molécula durante o fenômeno da fluorescência. O eixo da esquerda mostra o aumento da energia, onde uma molécula fluorescente típica apresenta um espectro de absorção. Este espectro mostra a energia ou os comprimentos de onda nos quais a molécula absorve luz.
Decaimento do tempo de vida da fluorescência da fluoresceína (vermelho), resposta do instrumento (azul) e ajuste (verde).
Em termos simples, o tempo de vida da fluorescência de uma molécula é o tempo médio que ela permanece no estado excitado. Isso depende do tipo de molécula e do seu ambiente local. Tipicamente, o estado excitado decai de forma exponencial, como indicado na equação abaixo. O uso do tempo de vida da fluorescência apresenta vantagens em relação à medição da intensidade, pois se trata de uma medição "absoluta", em vez da medição "relativa" do estado estacionário (que fornece um sinal médio ao longo do tempo).
I(t) = I 0 exp (-t/τ)
τ é o tempo de vida da fluorescência ou o tempo necessário para que a intensidade decaia para 1/e do seu valor inicial.
Se houver mais de um estado excitado presente, às vezes porque a amostra em estudo contém uma mistura de moléculas fluorescentes e existem diferentes ambientes locais ou uma molécula sofre uma transformação, dando origem a diferentes espécies de estado excitado, espera-se que o decaimento seja mais complexo. Pode haver um decaimento exponencial para cada estado excitado presente. Isso pode ser representado por uma soma de exponenciais (veja abaixo), onde α (o fator pré-exponencial) indica a concentração relativa de cada decaimento t em relação ao decaimento geral observado.
Equações para obtenção de tempos de vida de fluorescência, constantes de tempo dos componentes, amplitudes e médias.
Para comparar medições, muitas vezes é útil normalizar os fatores pré-exponenciais de alguma forma. Se for necessária uma comparação da concentração de cada espécie fluorescente, pode-se usar o α normalizado. Se for necessária uma comparação da contribuição para o espectro em estado estacionário (emissão de fluorescência total), pode-se usar a amplitude fracionária ou relativa (em %). Esta última é o fator pré-exponencial ponderado pelo tempo de vida.
Em alguns casos, pode ser igualmente aceitável representar um decaimento complexo por meio de uma média de tempo de vida. No entanto, é importante ressaltar que a melhor maneira de fazer isso é modelando corretamente o decaimento complexo, em vez de simplesmente tentar ajustar um decaimento exponencial simples a ele. Na maioria dos casos, o uso da média de tempo de vida da amplitude é apropriado; contudo, ao considerar experimentos de extinção, é mais correto empregar a média de tempo de vida da fluorescência da intensidade. Existem trabalhos publicados que detalham os méritos relativos dessas médias. (Lakowicz, 2006) (Berezin, 2010)
As medições de fosforescência utilizam uma fonte pulsada de maior duração, como uma lâmpada de flash de xenônio.
A fosforescência é um processo no qual o fóton é emitido não a partir de um estado excitado singleto, mas sim de um estado tripleto proibido. A escala de tempo da emissão geralmente varia de picossegundos a nanossegundos, enquanto a fosforescência tipicamente dura microssegundos, milissegundos ou até mesmo mais tempo... minutos ou horas. Os pesquisadores geralmente usam uma fonte pulsada, como uma lâmpada de flash ou um LED, para medir os espectros e decaimentos de fosforescência nessas escalas de tempo mais longas. As medições de fosforescência utilizam uma fonte pulsada de vida útil mais longa, como uma lâmpada de flash de xenônio. O tempo de emissão da lâmpada pode ser usado para medir espectros em diferentes tempos de vida da fosforescência.
As medições de fosforescência utilizam uma fonte pulsada de longa duração, como uma lâmpada de flash de xenônio. O tempo de emissão da lâmpada pode ser usado para medir espectros em diferentes tempos de vida da fosforescência.
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