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Como calcular a relação sinal-ruído
Determinação da relação sinal-ruído de um espectrofluorômetro: métodos e fórmulas para garantir comparações de sensibilidade precisas.
A fluorescência é uma técnica analítica altamente sensível, portanto, uma das principais especificações a serem consideradas na seleção de um espectrofluorímetro é a sua sensibilidade. A sensibilidade geral de um espectrofluorímetro é determinada por muitos fatores, incluindo, mas certamente não se limitando a, o projeto óptico, a óptica de acoplamento, a intensidade da luz de excitação fornecida, a eficiência da coleta de fluorescência, o projeto do espectrômetro, a tecnologia do detector e muito mais. Por exemplo, um sistema com uma lâmpada de maior potência não garante, necessariamente, uma melhor sensibilidade geral à fluorescência.
Considerando a grande quantidade de variáveis envolvidas na fabricação de um fluorômetro sensível, o que se faz necessário é um teste de referência padrão que possa ser realizado por qualquer usuário, para comparar adequadamente um fluorômetro com outro.
No passado, alguns fabricantes comerciais de fluorômetros utilizavam limites de detecção para moléculas fluorescentes específicas, como sulfato de quinina ou fluoresceína, para demonstrar a sensibilidade. Contudo, atualmente, os fluorômetros de maior sensibilidade conseguem detectar concentrações tão baixas de fluoróforos que a capacidade de realizar diluições seriadas com precisão até esses limites de detecção torna-se questionável. Assim, o teste Raman em água tornou-se um padrão da indústria como uma boa medida da sensibilidade relativa entre diferentes instrumentos. O teste Raman em água também é preferível porque a água ultrapura está prontamente disponível em todo o mundo, a amostra é estável, o sinal é relativamente fraco e a banda Raman da água pode ser medida em toda a faixa de comprimento de onda do instrumento, permitindo comparações mais robustas do que as possíveis com uma única sonda fluorescente. Essa especificação de sensibilidade é derivada de um espectro de emissão da banda vibracional Raman da água pura. Normalmente, é obtido com o comprimento de onda de excitação selecionado em 350 nm, com uma varredura de emissão de 365 a 450 nm. Em geral, a sensibilidade do fluorômetro é expressa pela relação sinal-ruído (SNR), que é uma comparação entre o valor de um sinal na presença de outro sinal e o valor do ruído do sistema na ausência de sinal.
Infelizmente, nem todos os fabricantes utilizam as mesmas condições experimentais para adquirir esse conjunto de dados, e também não utilizam as mesmas fórmulas para calcular a relação sinal-ruído (SNR) dos dados adquiridos. Não existe uma maneira certa ou errada de coletar ou analisar dados, mas é evidente que diferentes métodos e análises podem gerar resultados bastante distintos. Portanto, é importante saber não apenas como o espectro Raman da água foi adquirido, mas também como os dados foram tratados. Se você puder garantir que os dados sejam adquiridos e analisados da mesma maneira, poderá fazer uma comparação justa entre dois fluorômetros diferentes.
Nesta nota técnica, destacamos os diferentes fatores que influenciam a relação sinal-ruído e explicamos o método HORIBA, para que os investigadores tenham as ferramentas necessárias para fazer uma comparação adequada.
Há décadas, HORIBA define a relação sinal-ruído (SNR) como a diferença entre o sinal de pico e o sinal de fundo, dividida pela raiz quadrada do sinal de fundo. Chamamos isso de método FSD (Primeiro Desvio Padrão).
Também é conhecido como método da raiz quadrada (SQRT).
A fórmula da relação sinal-ruído FSD é mostrada abaixo.
O sinal de pico é medido na intensidade do pico Raman da água em 397 nm (para excitação de 350 nm) e o ruído em uma região onde nenhum sinal Raman está presente (450 nm). Para um sistema óptico perfeito, não haveria sinal em 450 nm, pois não há emissão Raman nesse comprimento de onda; no entanto, todos os sistemas eletro-ópticos apresentam algum nível de luz espúria e ruído, que contribuirá para um sinal em 450 nm. A fórmula acima assume que o ruído é regido pela estatística de Poisson e, portanto, pode ser calculado como a raiz quadrada da contagem do sinal de base em 450 nm. Ela é aplicável apenas à detecção por contagem de fótons; portanto, para fins de comparação, deve ser usada somente ao comparar dois espectrofluorímetros de contagem de fótons.
Outro método comumente usado é dividir a diferença entre o sinal de pico e o sinal de fundo pelo valor da raiz quadrada média (RMS) do ruído no sinal de fundo. Este segundo método é utilizado por diversos fabricantes e é a melhor abordagem para espectrofluorímetros que utilizam detectores analógicos, onde as unidades de intensidade variam de um fabricante para outro.
A fórmula da relação sinal-ruído RMS é mostrada abaixo.
Para medir corretamente o valor de ruído RMS do denominador, um segundo experimento é realizado, no qual o fluorômetro excita a 350 nm e a cinética é medida em função do tempo com emissão a 450 nm.
A fórmula do RMS é dada por,
Onde o sinal de fundo baseado no tempo é medido n vezes e S é o valor médio da intensidade ao longo da varredura cinética.
Nem todas as empresas usam a fórmula RMS acima. Algumas usam o ruído pico a pico dos dados fora do pico, digamos, de 420 a 450 nm, e outras ainda usam uma estimativa RMS, seja da porção fora do pico do espectro, seja de uma varredura cinética secundária do pico. No final, o método para determinar o ruído RMS não é tão crítico quanto aplicar a mesma fórmula exata a quaisquer comparações que se queira fazer.
Em conclusão, não existe uma maneira ideal de calcular a relação sinal-ruído para a banda Raman da água, e diferentes empresas fazem isso de maneiras diferentes. O método FSD é válido apenas para comparar espectrofluorímetros de contagem de fótons. Ao comparar um ou mais sistemas que utilizam detecção analógica, deve-se usar o método RMS, ou algum método de estimativa de RMS.
Desde que os diferentes conjuntos de dados calculem a sensibilidade da mesma maneira, qualquer método específico fornecerá uma medida relativa da relação sinal-ruído (SNR) de um espectro em comparação com outro.
Assim como a fórmula usada para calcular a relação sinal-ruído pode ter um efeito drástico na sensibilidade aparente de qualquer conjunto de dados espectrais específico, a configuração de hardware do instrumento e os parâmetros experimentais da aquisição de dados também têm um efeito drástico na qualidade do espectro adquirido.
Existem muitos parâmetros, configurações e opções de hardware que afetam a sensibilidade medida de um espectrofluorímetro. Isso pode tornar extremamente difícil comparar com precisão a sensibilidade relativa de dois instrumentos diferentes, caso não sejam utilizados de maneira praticamente idêntica. A seguir, discutiremos cada um desses fatores e o impacto que eles têm nos dados obtidos.
Comprimento de onda de excitação: O comprimento de onda de excitação deve ser idêntico para todos os sistemas comparados. O método HORIBA utiliza excitação a 350 nm para a banda Raman da água, assim como a maioria dos outros fabricantes. Quando a excitação é feita a 350 nm, a banda de emissão Raman da água apresenta um pico em 397 nm.
Felizmente, a maioria dos fabricantes padronizou esse comprimento de onda de excitação, pois isso permite uma melhor comparação. No entanto, é perfeitamente válido alterar o comprimento de onda de excitação para qualquer outro valor como forma de testar a sensibilidade em uma faixa de comprimento de onda diferente (por exemplo, o infravermelho próximo).
Faixa de varredura de emissão: O método HORIBA varre o monocromador de emissão de 365 a 450 nm, com incrementos de 0,5 nm, de forma a coletar todo o pico Raman em 397 nm e também o sinal de fundo em 450 nm.
Largura de banda (tamanho da fenda): O método HORIBA utiliza fendas de passagem de banda de 5 nm tanto no espectrômetro de excitação quanto no de emissão. Alguns fabricantes especificam fendas de 10 nm, o que tem o efeito de aumentar a sensibilidade em comparação com 5 nm. Foi relatado que dobrar o tamanho físico da fenda na entrada e na saída de um monocromador pode quadruplicar a intensidade da excitação e a taxa de detecção da emissão, uma vez que a taxa de detecção aumenta com o quadrado do tamanho da fenda. No entanto, essa é uma estimativa simplista que deve ser medida empiricamente. HORIBA mediu a diferença de fator com o HORIBA Fluoromax e observou que, para o Fluoromax, dobrar o tamanho das fendas de 5 para 10 nm aumenta a relação sinal-ruído geral para a banda Raman da água em mais de 3 vezes. Contudo, isso pode variar para todos os fluorômetros, portanto, certifique-se de comparar com larguras de banda idênticas.
Tempo de integração (ou tempo de resposta): Refere-se ao tempo que o detector tem para coletar um sinal em uma determinada posição de comprimento de onda. Ele também desempenha um papel significativo na sensibilidade geral medida para um fluorômetro. O método HORIBA utiliza um tempo de integração de 1 segundo em cada ponto de comprimento de onda, semelhante a outros fabricantes. No entanto, alguns fabricantes especificam um tempo de resposta de 2 segundos, o que aumenta a relação sinal-ruído geral em quase o dobro. Certifique-se de usar o mesmo tempo de integração (resposta) ao comparar.
Tipo de PMT: A maioria espectrofluorímetros utiliza um tubo fotomultiplicador (PMT) como único detector de emissão de fluorescência, sem opção de troca do invólucro do detector. Isso se aplica à maioria dos fluorômetros analíticos de bancada. Alguns desses sistemas de bancada permitem a seleção de diferentes PMTs individuais com diferentes faixas de comprimento de onda e especificações. PMTs que não detectam tão longe no infravermelho próximo (NIR) quanto outros PMTs terão uma contagem escura menor, proporcionando assim uma melhor relação sinal-ruído na faixa de 350 a 400 nm; no entanto, podem não ser utilizáveis em toda a faixa de comprimento de onda de emissão desejada para um determinado laboratório. O PMT padrão da HORIBA, utilizado nas séries de fluorômetros FluoroMax Plus, Fluorolog3 e QuantaMaster 8000, é o Hamamatsu R928P, considerado o padrão da indústria para fluorometria. Nesses casos, certifique-se de que cada fluorômetro esteja utilizando o mesmo PMT, sempre que possível.
Filtros Ópticos: Um filtro óptico pode ser adicionado ao caminho óptico de um fluorômetro, tanto no lado da excitação quanto no lado da emissão da amostra. Esses filtros podem ser inseridos manualmente em um suporte dentro do compartimento da amostra, ou podem fazer parte de uma roda de filtros que posiciona automaticamente diferentes filtros no caminho óptico quando diferentes protocolos experimentais são selecionados. Os filtros ópticos têm o efeito de melhorar a rejeição de luz espúria em determinados comprimentos de onda e podem melhorar drasticamente a relação sinal-ruído (SNR) de um fluorômetro. HORIBA não utiliza filtros ópticos, além dos próprios espectrômetros de varredura, ao especificar a SNR para Raman da água com as especificações das séries Fluoromax, Fluorolog3 ou QuantaMaster 8000. Ao comparar um fluorômetro HORIBA com um fluorômetro que utiliza filtros automáticos, por favor, não utilize um filtro. Se o fluorômetro for automático, confirme a marca e o tipo de filtros utilizados e onde eles são empregados, para replicar um método experimental similar com um fluorômetro HORIBA.
Tipo de detector: Fluorômetros modulares de pesquisa normalmente incluem um alojamento para fotomultiplicadora (PMT) como padrão, mas permitem diversos tipos de detectores de canal único para ampliar a faixa de comprimento de onda ou o tempo de vida da fluorescência do instrumento. Detectores alternativos incluem alojamentos de PMT refrigerados, vários detectores de estado sólido, como InGaAs, PMTs de MCP e assim por diante. Esses diferentes tipos de detectores terão efeitos significativos na relação sinal-ruído de qualquer medição de amostra específica; portanto, ao comparar a sensibilidade de um fluorômetro com outro, certifique-se de que o mesmo tipo de detector seja usado para coletar dados em ambos os sistemas.
Temperatura do detector: A maioria espectrofluorímetros comerciais utiliza carcaças de fotomultiplicadora (PMT) sem refrigeração e, na verdade, muitos instrumentos sequer oferecem a opção de detector refrigerado. Uma carcaça de PMT refrigerada pode melhorar a sensibilidade do instrumento, reduzindo a contagem de ruído (ruído de fundo) em comparação com a mesma PMT em uma carcaça sem refrigeração. As carcaças de PMT padrão da HORIBA nos modelos FluoroMaxPlus, Fluorolog3 e QuantaMaster 8000 são sem refrigeração; no entanto, as séries Fluorolog3 e QuantaMaster 8000 oferecem carcaças de PMT refrigeradas opcionais para melhorar a sensibilidade e a detecção no infravermelho próximo (NIR). Ao comparar fluorômetros modulares de pesquisa, certifique-se de comparar os dados coletados com o mesmo tipo de carcaça de PMT (sem refrigeração ou refrigerada) e, se refrigerada, que a temperatura tenha sido a mesma.
Monocromador simples versus duplo: Fluorômetros modulares de pesquisa permitem que o pesquisador selecione monocromadores simples ou duplos no caminho óptico de excitação ou emissão. Aqui, o termo monocromador duplo refere-se a dois estágios de grade dispersiva, um após o outro, com uma fenda de entrada, uma fenda intermediária e uma fenda de saída. Um monocromador duplo pode ser configurado no modo aditivo ou dispersivo, mas em ambos os casos, a taxa de transferência e as características de luz espúria de um monocromador simples versus um duplo são muito diferentes e terão um grande impacto na relação sinal-ruído (SNR) de uma varredura Raman da água, mesmo que as larguras de banda, os tempos de integração e os comprimentos de onda sejam mantidos constantes.
Densidade de ranhuras da grade de difração: A densidade de ranhuras de uma grade de difração também afeta a taxa de transferência e, consequentemente, a sensibilidade de um espectrofluorímetro. Para a maioria espectrofluorímetros isso não representa um grande problema, pois os sistemas são fabricados com apenas uma grade de difração específica. Nesse caso, o mais importante é garantir que as larguras de banda selecionadas sejam as mesmas. No entanto, para fluorômetros modulares, é possível configurar os monocromadores com grades de difração diferentes ou múltiplas. Para esses sistemas, é preciso ter muito cuidado para manter as características o mais semelhantes possível. Por exemplo, quando se tem dois instrumentos com espectrômetros de distância focal semelhante, alterar a densidade de ranhuras da grade de difração aumentará ou diminuirá a sensibilidade para a mesma largura de banda de 5 nm. O método HORIBA utiliza grades de difração com uma densidade de 1.200 ranhuras por milímetro.
Ângulo de Brilho da Grade: As grades selecionadas para um monocromador de excitação ou emissão proporcionam o rendimento ideal em uma determinada faixa de comprimento de onda, conhecida como ângulo de brilho, uma vez que este é determinado pelo ângulo de gravação da grade em sua superfície. Assim, um monocromador de excitação com um ângulo de brilho de 350 nm e um monocromador de emissão de 400 nm seriam as escolhas ideais para obter a melhor sensibilidade Raman da água ao excitar em 350 nm. Como a maioria dos fluorômetros não permite o ajuste da grade, essa variável não é um fator relevante, mas para aqueles que permitem a escolha das grades, certifique-se de selecionar grades com o mesmo ângulo de brilho, ou ângulos de brilho muito semelhantes, para uma comparação válida.
As condições experimentais para a varredura de emissão Raman da água ultrapura foram as seguintes.
Espectrofluorômetro QuantaMaster QM-8075-11 (lâmpada de xenônio de 75 watts, monocromador de excitação e emissão únicos) com alojamento PMT refrigerado opcional.
Os resultados experimentais encontram-se abaixo.
Note-se que este resultado específico excede a especificação mínima de FSD (distância focal livre) para Raman de água HORIBA para o espectrofluorímetro QM-8075-11 quando equipado com um PMT (microtransdutor fotovoltaico) R928 refrigerado opcional, que atualmente é especificado em > 30.000:1 (Método FSD).
Resultados de Raman FSD da água
Embora seja necessário ter cuidado para garantir que as condições experimentais e as fórmulas matemáticas sejam aplicadas de forma consistente, a relação sinal-ruído do espectro Raman da água é um bom indicador da sensibilidade relativa de um fluorômetro em comparação com outro.
Ao comparar espectrofluorímetros de contagem de fótons, o método FSD (SQRT) é o preferido.
HORIBA possui uma longa tradição de excelência na fabricação de dispositivos de fluorescência e temos o prazer de demonstrar exatamente as condições com as quais atingimos nossas especificações de sensibilidade líderes do setor.
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