Técnicas de tempo de vida de fluorescência: TCSPC, FRET, TRES e SSTD

TCSPC significa contagem de fótons únicos correlacionados no tempo. É um método que utiliza a temporização de uma fonte de excitação pulsada, como um laser ou LED, com a temporização da chegada de fótons individuais em um detector para reconstruir o decaimento do tempo de vida ao longo de muitos eventos (repetição de pulsos e fótons detectados). Essa técnica se baseia no fato de que a probabilidade de detectar um único fóton no instante t após um pulso de excitação é proporcional à intensidade de fluorescência no instante t.

A repetição de um laser ou LED pulsado a uma taxa de repetição relativamente alta (10 kHz a 100 MHz) é sincronizada com o instante em que o próximo fóton chega a um detector (por exemplo, um fotomultiplicador). Circuitos eletrônicos de temporização, como conversores tempo-digital ou tempo-amplitude (TAC), são usados para registrar esses eventos sucessivamente, até que estatísticas suficientes sejam coletadas para reconstruir o decaimento. O decaimento é então ajustado a uma função exponencial para modelar o tempo de vida (t). A técnica TCSPC é tipicamente usada para medir tempos de vida de fluorescência na escala de picossegundos a microssegundos.

Utilizando o modo cinético TCSPC, medições individuais podem ser realizadas em apenas 1 ms e até 10.000 medições podem ser adquiridas continuamente. Desde que ocorra uma mudança no tempo de vida da fluorescência, essa abordagem, em vez da intensidade, pode ser usada para acompanhar um processo cinético.

Obviamente, é necessário um número suficiente de fótons para analisar os dados. Isso pode ser melhorado usando uma taxa de repetição muito alta, mas o tempo de vida e o intervalo de tempo precisam ser considerados para não reexcitar a amostra antes que ela tenha decaído completamente. Os dados de tempo de vida podem então ser usados para construir curvas cinéticas para o processo.

Se você consegue medir fluorescência, consegue medir FRET (Transferência de Energia por Ressonância de Förster). FRET é a interpretação do resultado da medição, e não uma técnica de medição em si. O FRET ocorre quando a emissão de uma molécula doadora se sobrepõe à absorção de uma molécula receptora. Quando as duas estão suficientemente próximas, elas sofrem uma interação dipolo-dipolo e ocorre a transferência de energia. A distância na qual há 50% de transferência de energia é chamada de distância de Förster, e esse valor é geralmente conhecido para pares FRET comuns. Medindo-se a variação da intensidade de fluorescência ou do tempo de vida da molécula doadora na presença da receptora, é possível determinar a eficiência do FRET e, portanto, a distância entre as duas. O FRET pode ser medido usando espectros de fluorescência (intensidades) ou tempos de vida de fluorescência.

São necessárias várias medições: ID, a intensidade (ou t_{_D}, o tempo de vida) medida no pico de emissão do doador isolado; I _{_DA}, a intensidade (ou t _{_DA}, o tempo de vida) medida no pico de emissão do doador na presença de um aceptor; I _{_A}, a intensidade (ou t_{_A}, o tempo de vida) medida no pico de emissão do doador com a presença de um aceptor, mas sem o doador; e I_{_B}, a intensidade (ou t_{_B}, o tempo de vida) medida no pico de emissão do doador usando uma solução em branco (ou seja, apenas tampão). A partir dessas medições, a eficiência, E, pode então ser usada juntamente com a distância de Förster (R _₀) para calcular R, a distância entre as moléculas do doador e do aceptor que está sendo medida. Veja as equações na figura acima.

O termo quenching refere-se à redução da emissão de fluorescência, ou seja, ao aumento da taxa de decaimento não radiativo (knr). O quenching pode ser dividido em formas “estática” e “dinâmica”. Em ambos os casos, a intensidade de emissão diminui, mas apenas no quenching dinâmico ocorre uma alteração no tempo de vida da fluorescência. Nota: Se a cinética seguir a cinética de Stern-Volmer e for utilizado um tempo de vida médio, este deve ser calculado utilizando a média da intensidade.

O efeito do fotobranqueamento aumentará o tempo de execução da medição, pois reduz efetivamente o número de fluoróforos emissores (ou seja, age como uma diminuição na concentração) e reduz a intensidade da emissão. O tempo de vida não será afetado.

A espectroscopia de emissão resolvida no tempo (TRES) é uma técnica que mede o decaimento da fluorescência em comprimentos de onda incrementais ao longo do espectro de emissão de uma amostra. Obtém-se um gráfico 3D da intensidade em função do tempo e do comprimento de onda. Ao analisar esse conjunto de dados 3D na direção dos espectros em diferentes instantes de tempo, em vez dos decaimentos em diferentes comprimentos de onda, é possível medir o espectro de emissão resolvido no tempo. Se uma amostra contém múltiplos emissores com espectros sobrepostos, mas com tempos de vida diferentes, os espectros individuais desses componentes podem ser separados usando TRES.

Por exemplo, o 2-naftol se ioniza para formar 2-naftolato no estado excitado (Koti, 2001). O espectro de emissão no estado estacionário mostra dois picos, indicando a presença de ambas as espécies. A medição do tempo de vida em comprimentos de onda incrementais ao longo do espectro de emissão mostra taxas de decaimento muito diferentes em cada pico de emissão. Ajustando os decaimentos, é possível observar como os tempos de vida e/ou amplitudes dos componentes se alteram em diferentes comprimentos de onda de emissão.

Para o 2-naftol, o pico de emissão em 354 nm apresenta um tempo de vida diferente do pico de emissão do 2-naftolato em torno de 414 nm. O modelo de dois estados, ionizado e não ionizado, do 2-naftol é claramente demonstrado no espectro TRES. Duas constantes de tempo representam os diferentes tempos de decaimento para o 2-naftol (3,4 ns, dominante em 357 nm) e para o 2-naftolato (9,4 ns, dominante em 414 nm). Os dados apresentados abaixo foram obtidos em um espectrômetro FluoroMax-4 com eletrônica FluoroHub TCSPC e uma fonte de excitação NanoLED-280 operando a 1 MHz.

Outra aplicação da TRES é a medição das constantes de tempo de reorientação do solvente (Horng, 1995). Observando um único fluoróforo e como o espectro de emissão se desloca ao longo do tempo, a energia do pico em função do tempo pode ser plotada e ajustada para obter uma constante de tempo. O deslocamento do espectro, nesse caso, pode ser devido às moléculas do solvente reorientarem seus momentos dipolares em resposta ao momento dipolar do estado excitado do fluoróforo. Ajustando a energia do pico do espectro de emissão ao longo do tempo, é possível obter a(s) constante(s) de tempo de reorientação das moléculas do solvente (Horng, 1995).

Sim. Existem algumas maneiras de fazer isso, dependendo da amostra. Uma medição cinética de TCSPC pode ser realizada para monitorar a ligação caso o tempo de vida se altere durante o processo de ligação. A anisotropia resolvida no tempo também pode ser empregada, pois a ligação afetará o tempo de correlação rotacional. Como isso se deve à mudança no tamanho efetivo da molécula, o tempo de correlação rotacional é proporcional ao volume efetivo da molécula.

Em um exemplo, utiliza-se um atraso após o flash da lâmpada para medir o espectro de fosforescência. Sem esse atraso, é possível observar tanto a fluorescência de curta duração do peptídeo na amostra quanto a fosforescência de longa duração do térbio.

Variando o atraso, é possível detectar seletivamente espécies com fosforescência de maior duração, separando-as da fluorescência de fundo na mesma amostra.

A composição de lantanídeos em materiais vítreos pode ser estudada usando decaimentos de fosforescência com resolução temporal. Apresentamos aqui dados do estudo do teor de érbio em diferentes vidros utilizando esse método. O tempo de vida do érbio pode variar de acordo com o tipo de vidro e o processo de fabricação.

A técnica boxcar, ou média boxcar, é um método para medir o decaimento da fosforescência ou da fluorescência de longa duração, integrando em janelas de integração fixas ao longo do tempo de decaimento do sinal.

Uma fonte pulsada, como uma lâmpada de flash de xenônio, é acionada e um atraso é definido após o pulso (idealmente, o tempo em que o flash da lâmpada termina). O detector mede repetidamente uma janela de integração para obter uma média estatística da intensidade nessa janela após o flash. Em seguida, a janela de integração é movida incrementalmente ao longo do decaimento para tempos de decaimento mais longos. Dessa forma, um decaimento é produzido e pode ser ajustado com um decaimento exponencial para obter a vida útil pelo inverso da taxa de decaimento. A técnica boxcar pode ser muito lenta, especialmente com decaimentos de longa duração e emissores fracos. No entanto, dependendo da largura do pulso de xenônio, vidas úteis entre 10 μs e segundos podem ser resolvidas de maneira relativamente barata, usando uma fonte de luz sintonizável.

SSTD significa digitalizador transiente de disparo único. A técnica SSTD utiliza uma fonte de luz pulsada, seja um laser pulsado ou uma lâmpada de flash de xenônio, para adquirir uma curva completa de decaimento da fosforescência a partir de cada pulso da fonte. Após cada pulso, o decaimento é capturado e digitalizado em tempo real com um fotomultiplicador (PMT) e um digitalizador transiente. Uma média rápida do sinal pode ser facilmente obtida, uma vez que um decaimento completo é medido após cada disparo. Os espectros com resolução temporal podem ser facilmente medidos por integração numérica do sinal de decaimento dentro do intervalo de tempo definido pelo usuário e varredura de um monocromador. Isso permite discriminar espectros com base no tempo de vida do respectivo estado excitado.

A emissão de fluorescência ocorre na escala de tempo de picossegundos a nanossegundos, enquanto a fosforescência, medida com SSTD, ocorre na escala de tempo de microssegundos a segundos. Variando a posição temporal e a largura do intervalo de detecção do sinal, é possível detectar seletivamente os espectros de fluorescência e fosforescência, como atestam os espectros de fenantreno na figura anexa. Aqui, a emissão de fenantreno em um vidro congelado foi medida com um atraso temporal do intervalo de detecção gradualmente aumentado para diminuir a contribuição da fluorescência.

Um exemplo de aplicação do SSTD pode ser visto no caso da fosforescência à temperatura ambiente (RTP) do triptofano da Nase T1. Nesse caso, o sinal foi extraído eliminando-se a fluorescência intensa do triptofano, o que seria extremamente difícil de fazer usando uma fonte de excitação contínua. O decaimento da fosforescência da emissão muito fraca também foi medido no mesmo instrumento usando a função Single Shot Transient Digitizer (SSTD) (HORIBA PTI QuantaMaster Series, 2017).

A técnica óptica estroboscópica boxcar, também conhecida como técnica Strobe, é uma técnica pulsada no domínio do tempo que emite um pulso de luz e, em seguida, ativa um fotomultiplicador (PMT) através da varredura de um pulso de alta tensão de curtíssima duração ao longo da cadeia de dinodos do PMT. Posteriormente, esses pulsos são repetidos e, por meio de um gerador de atraso, a intensidade é medida em um instante diferente após o pulso, para construir uma curva de decaimento. Este método utiliza múltiplos pulsos e a média dos valores para melhorar a relação sinal-ruído do decaimento.

A técnica Strobe é uma técnica analógica inerentemente menos sensível que a TCSPC e não possui a mesma estatística de Poisson. No entanto, ela tem a vantagem de fornecer decaimentos de aproximadamente 150 ps a segundos com fontes de baixa taxa de repetição, como diodos laser, LEDs, OPOs comutados por Q sintonizáveis ou lasers de nitrogênio/corante. A técnica Strobe permite medir espectros com resolução temporal de nanossegundos diretamente, fixando a posição do gate de retardo e varrendo o monocromador de emissão.

Uma das vantagens do Strobe é a capacidade de coletar decaimentos em escalas de tempo lineares e não lineares (ou seja, progressão aritmética e logarítmica). Esta última característica auxilia significativamente na resolução de decaimentos multi-exponenciais, nos quais os tempos de vida podem diferir em várias ordens de magnitude. Outra vantagem da técnica Strobe é a compatibilidade com lasers sintonizáveis de baixa taxa de repetição, como lasers Q-switched/OPO ou lasers de nitrogênio/corante, que não podem ser usados com TCSPC. Além disso, o Strobe também funciona com LEDs e diodos laser operando em frequências de até aproximadamente 25 kHz.

Um exemplo de tempo de vida medido com estroboscópio é a análise de decaimento e distribuição do tempo de vida em lâminas de ZnO, conforme mostrado na figura a seguir.

A conversão ascendente de fluorescência é um processo de dois fótons, no qual uma amostra é excitada por dois fótons contemporâneos que chegam simultaneamente na região do infravermelho próximo, e a fluorescência é emitida em uma energia mais alta (comprimento de onda mais baixo) na região visível do espectro.

Embora a potência de excitação necessária dependa da amostra em questão, a conversão ascendente normalmente requer uma fonte de excitação com fluxo de fótons mais elevado, como um laser. Por isso, fontes TCSPC padrão podem não ter o fluxo necessário para realizar medições de conversão ascendente. Lasers que emitem em 980 nm podem ser montados diretamente no compartimento da amostra para excitá-la diretamente e, assim, medir espectros de conversão ascendente, tempos de vida ou mesmo rendimentos quânticos. Lasers OPO com comutação Q e emissão NIR eficiente também podem ser usados para medir a conversão ascendente de fluorescência.

Moléculas que absorvem luz no infravermelho próximo (NIR) e podem ser detectadas ou mesmo visualizadas na faixa visível são úteis. Isso ocorre porque fontes de excitação UV de alta energia tendem a sofrer fotobranqueamento ou causar fotodanos em amostras biológicas. As fontes NIR excitam em energias mais baixas e normalmente não apresentam esse problema. Moléculas que exibem conversão ascendente de fluorescência incluem lantanídeos, nanopartículas semicondutoras e pontos quânticos. O mesmo laser DPSS de 980 nm pode ser pulsado por pulsos TTL e usado para medições de tempo de vida de conversão ascendente de fotoluminescência (PL), seja com a função MCS da placa TCSPC ou com a técnica SSTD.

Embora a fluorescência (e a fosforescência) tenha uma ampla gama de aplicações, existem duas áreas principais de pesquisa onde o uso desse fenômeno se destaca:

• Ciências da vida
• Ciência dos materiais

Em qualquer aplicação onde se observe fluorescência em estado estacionário, pode ser vantajoso empregar métodos de tempo de vida para obter informações. Algumas dessas aplicações e técnicas de fluorescência que podem ser empregadas em seu estudo são ilustradas abaixo.

Ciências da Vida

Ciências dos Materiais